極薄ポリジメチルシロキサン マイクロ流体チップを用いた保水ライブ線虫個人の固定化
Summary
生きている線虫のターゲット照射を許可する一連の固定化メソッドが確立されている保水性を持つチップの最近開発された超薄型ポリジメチルシロキサン マイクロ流体を使用して、個人。新規チップ上への固定化してイメージング観測に適しています。詳細な治療とチップのアプリケーション例を説明しています。
Abstract
イオンビーム育種および生物学的には放射線、広く、これらの方法のマイクロビーム照射は生物に放射線感受性のサイトを識別する強力な手段を表します。本稿では、線虫の生きている個人のターゲットを絞ったマイクロビーム照射のため開発されたチップ上への固定化方法のシリーズについて説明します。特に、我々 は以前麻酔の詳細を説明するためにc. の elegansを必要とせず個人を固定するために開発ポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロ流体チップの治療。ワーム シートと呼ばれる、このチップは弾力性のあるマイクロ チャネル拡大することを許可して弾力性により、動物に優しく包まれます。また、PDMS の自己吸着能力により動物で密封できるチャンネル、動物はプッシュされないチャネルにエンクロージャの薄いカバー フィルム付きワーム シートの表面を覆うことによって。カバー フィルムを回して、簡単に動物を収集できます。さらに、ワームのシートは保水性を示し、 c. の elegans個人ライブ条件下で長時間観察を受けることができます。さらに、シートはのみを検出するイオン粒子がように動物を囲むシートを通過する炭素イオンなどの重イオン応用線量を正確に測定でき、厚さ 300 μ m です。動物を囲むために使用カバー フィルムの選択は成功した長期的な固定化のため非常に重要な適したカバー フィルムの選択を行い、いくつかの映画の中で推奨されるものを示した。チップのアプリケーション例として紹介したマイクロビーム照射と同様に、ワーム シートのマイクロ流路を囲む動物の筋活動のイメージング観測。これらの例は、ワーム シートが生物学的実験の可能性を大きく拡大していることを示します。
Introduction
がんの診断と治療、生物学的アプリケーションとイオンビーム育種、放射線、x 線、ガンマ線、重イオンビームなどが使用されています。多くの研究と技術開発は、現在放射線1,2,3の効果に着目します。マイクロビーム照射体内放射線感受性のサイトを識別する強力な手段である生物4。高崎高度な放射線研究所の国立機構量子放射線科学と技術 (QST-高崎) は重イオンビームを用いた顕微鏡下で細胞に照射する技術を開発されました。マイクロビーム5、線虫4,6線虫、カイコ7、メダカなどのいくつかのモデル動物のターゲットを絞ったマイクロビーム照射を可能にする方法を確立しています。学(メダカ)8。線虫のc. の elegansのターゲットを絞ったマイクロビーム照射では、歩行などのプロセスにこれらのシステムの役割を識別するために役立つ、頭部の神経リングなど、特定の地域の効果的なノックダウンをことができます。
マイクロビーム照射4を許可する線虫麻酔を必要とせず個人のチップで固定する方法をしました。さらに、以前の研究4で使用されているマイクロ流体チップを改善するために最近開発したワーム (材料の表を参照) のためのシートと呼ばれる水和剤、イオン不可解、ポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロ流体チップ線虫 c. エレガンス個人9を固定します。これらは極薄の柔らかいシートの構成 (厚さ 300 μ m = 幅 = 15 mm 長さ = 15 mm) (20 または 25) ストレート マイクロ チャンネルで複数 (深さ = 70 μ m 幅 = 60 μ m または 50 μ m 長さ = 8 mm) 表面 (図 1の D)。マイクロ チャネルが開いているし、同時にそれらで囲む複数の動物を許可する (図 1E)。シートは弾力性のあるマイクロ チャネル (~ 10%、図 1F) によって拡大することを許可して弾力性により、動物に優しく包まれます。また、PDMS の自己吸着能力により動物で密封できるチャンネル、動物はプッシュされないチャネルにエンクロージャの薄いカバー フィルム付きワーム シートの表面を覆うことによって。カバー フィルムを回して、簡単に動物を収集できます。
囲まれてされているとき、または収集される場合、チャネルは、ワームを傷つけることはありません。さらに、シートは、本質的に疎水性である PDMS から作られていますが、保水性は素材に親水性を付与によって達成することができます。保水性と厚さは、ワームのシートの良好な特性です。保水容量長期安静後の動物の脱水を防ぐことができますができ実施される長期観察。
さらに、9を前述のよう、シートは、のみ 300 μ m 厚い、動物を囲むシートを通過する (水に約 1 mm の範囲) と炭素イオンなどの重イオンを許可します。これにより検出されるイオン粒子と応用の線量を正確に測定します。さらに、ワームのシートは再利用することができますして経済的なためします。従来の注入法で囲まれた動物が死んだ時とチャネルから取得できません。彼らの卵は、チャネルを詰らもことができます。これはチップを使用できなくなります。チップは、したがって、基本的には使い捨てと費用便益比が悪い。
本稿で述べる一連の生きている線虫のチップの固定化のためのメソッド ワーム シートを使用して、個人。動物のオンチップ固定後 3 h の歩行分析を通じて適切なカバー フィルムを評価しました。さらに、撮像観測とマイクロビーム照射のためのオンチップ固定化の例を示した。
Protocol
Representative Results
Discussion
水和剤 PDMS マイクロ流体チップを用いたライブ条件下でc. の elegansのチップの固定化が複数の動物の効率的なターゲットを絞ったマイクロビーム照射できます。処理と乾燥を防止する機能の使いやすさは、マイクロビーム照射のみならずいくつか行動アッセイのアプリケーションに適してこのシステムを作る。これらのワームのシートはすでに実用化されて、簡単に得ることができま?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は博士淳東谷麗の小林泰彦一郎横田と夫妻裕也服部線虫 c. エレガンスの貴重な議論のための治療に関する親切なアドバイスをありがちましょう。著者らは、線虫と大腸菌の菌株を提供する線虫の遺伝子センターをありがとうございます。照射実験とそのような支援、QST 高崎でティアラのサイクロトロンの乗組員に感謝しますこの原稿の下書きを編集して、博士スーザン ファーネスに感謝しますこの調査によってサポートされた部分で科研費 (許可番号 JP15K11921 および JP18K18839) 日本学術振興会から修士号を取得する
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
Riferimenti
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