Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica

Sommario

Una serie di metodi di immobilizzazione è stata stabilita per consentire l'irradiazione mirata di live Caenorhabditis elegans individui che utilizzano un microfluidici recentemente sviluppati polidimetilsilossano ultra-sottile chip con ritenzione idrica. Questa romanzo immobilizzazione su chip è anche sufficiente per osservazioni di imaging. Il trattamento dettagliata ed esempi di applicazione del chip sono spiegati.

Abstract

Radiazione è ampiamente usato per applicazioni biologiche e per l'allevamento del fascio di ioni, e tra questi metodi, microbeam irradiazione rappresenta un potente mezzo di identificazione radiosensibili siti negli organismi viventi. Questo articolo descrive una serie di metodi di immobilizzazione su chip sviluppato per l'irradiazione di microbeam mirata degli individui dal vivo di Caenorhabditis elegans. In particolare, il trattamento dei chip microfluidici polidimetilsilossano (PDMS) che abbiamo precedentemente sviluppato per immobilizzare gli individui di c. elegans senza la necessità per l'anestesia è spiegato in dettaglio. Questo chip, indicato come un foglio di vite senza fine, è resiliente per consentire i canali microfluidici essere ampliato e l'elasticità permette animali lasciarsi avvolgere delicatamente. Inoltre, a causa della capacità di auto-adsorbimento del PDMS, gli animali possono essere sigillati nei canali coprendo la superficie del foglio verme con una pellicola sottile copertina, in cui gli animali non vengono spinti nei canali per recinzione. Girando il coperchio della pellicola sopra, possiamo facilmente raccogliere gli animali. Inoltre, il foglio di vite senza fine Mostra la ritenzione idrica e permette agli individui di c. elegans di essere sottoposti ad osservazione microscopica per lunghi periodi in condizioni live. Inoltre, il foglio è solo 300 µm di spessore, consentendo gli ioni pesanti ad esempio ioni carbonio di passare attraverso il foglio che racchiude gli animali, consentendo in tal modo le particelle di ioni essere rilevato e la dose di radiazioni applicata deve essere misurata con precisione. Perché la selezione dei film di copertura utilizzato per racchiudere gli animali è molto importante per il successo a lungo termine immobilizzazione, abbiamo condotto la selezione dei film copertura adeguata e ha mostrato un consigliato uno tra alcuni film. Come un esempio di applicazione del chip, abbiamo introdotto imaging osservazione delle attività muscolare degli animali che racchiude il canale di microfluidica del foglio di vite senza fine, come pure l'irradiazione microbeam. Questi esempi indicano che i fogli di vite senza fine hanno notevolmente ampliato le possibilità per gli esperimenti biologici.

Introduzione

Radiazioni, tra cui i raggi x, raggi gamma e fascio di ioni pesanti, sono ampiamente usato per applicazioni biologiche come nella diagnosi del cancro e nel trattamento e per l'allevamento del fascio di ioni. Numerosi studi e sviluppi tecnici si stanno attualmente concentrando sugli effetti della radiazione^1,2,3. Microbeam irradiazione è un potente mezzo di identificazione radiosensibili siti nel vivere organismi⁴. Il Takasaki Advanced radiazione ricerca Istituto di istituti nazionali per Quantum e radiologici Science and Technology (QST-Takasaki) ha sv....

Protocollo

1. ceppi e manutenzione

1. Selezionare un ceppo adatto di c. elegans ed Escherichia coli (cibo) a seconda dello scopo dell'esperimento.
   Nota: Nel presente documento, è generalmente utilizzato selvaggio-tipo N2¹⁰c. elegans (Figura 2A) e HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V¹¹ è impiegato esclusivamente per analisi di imaging. E. coli OP50 è stato utilizzato come alimento per c. elegans. Alcuni mutanti con forma anomala del corpo, ad esempio il mutante di unc-119(e2498) III con un....

Risultati

Attivo di c. elegans individui potrebbero essere immobilizzati con successo usando un ultra-sottile, bagnabile PDMS, chip microfluidico (foglio di vite senza fine). Abbiamo studiato l'idoneità delle pellicole di copertina diversa per sigillare il foglio di vite senza fine, come descritto nel protocollo sezione 3. Per valutare gli effetti di tenuta dei film copertura, abbiamo determinato la motilità degli animali 3 h dopo immobilizzazione su chip con copertura in vetro (spessore: .......

Discussione

Immobilizzazione su chip di c. elegans in condizioni dal vivo utilizzando un bagnabile PDMS microfluidic chip consente l'irradiazione efficiente microbeam mirata di più animali. La facilità di movimentazione e caratteristiche per evitare l'essiccazione rendono questo sistema adatto per applicazioni non solo in microbeam irradiazione, ma anche in diversi saggi comportamentali. Questi fogli di vite senza fine sono già stati commercializzati e possono essere facilmente ottenuti. Chip microfluidici convenzionali, qu.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C. elegans ceppo wild-type	Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA	N2	Wild-type C. elegans ceppo generalmente utilizzato in questo studio
C. elegans unc-119(e2498) III mutante ceppo	Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA	CB4845	C. elegans ceppo impiegato solo come esempio di mutanti con forma corporea anormale...
C. elegans ceppo transgenico HBR4	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA	HBR4	Il genotipo di questo ceppo transgenico C. elegans è HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54– 3' utr, unc-119(+)]V. Questo ceppo è stato impiegato solo per l'osservazione delle immagini.
E. coli ceppo	Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USA	OP50	E. coli ceppo utilizzato come cibo per C. elegans
Worm Sheet IR (50/60)	Biocosm, Inc., Hyogo, Giappone	BCM17-0001	Chip microfluidico con 25 diritti 50/60-µ m canali di larghezza utilizzati in tutti gli esperimenti e le osservazioni in questo articolo
Foglio di vite senza fine 60	Biocosm, Inc., Hyogo, Giappone	BCM18-0001	Chip microfluidico con 20 60 diritti & micro; canali di larghezza m. Questo è adatto per gli adulti 3-5 giorni dopo la schiusa a 20 ° C.
Foglio di vite senza fine 50	Biocosm, Inc., Hyogo, Giappone	BCM18-0002	Chip microfluidico con 20 50 diritti & micro; canali di larghezza m. Questo è adatto per i giovani adulti ~ 3 giorni dopo la schiusa a 20 ° C.
MICRO VETRO DI COPERTURA	MATSUNAMI GLASS IND. LTD.	C030401	Vetro di copertura (spessore: 130-170 &; micro; m) utilizzato nei saggi di locomozione nel Protocollo 3
Film di polistirene	Biocosm, Inc., Hyogo, Giappone	BCM18-0001/ BCM18-0002	Articoli in bundle di fogli di vite senza fine. PS filim (spessore: ~130 µ m) utilizzato nei saggi di locomozione del Protocollo 3.
Pellicola di poliestere Lumirror	TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Giappone	Lumirror T60 (t 125 µ m)	Filo PET (spessore: 125 &; micro; m) utilizzato nei saggi di locomozione nel Protocollo 3
IWAKI 60 mm/piatto non trattato	AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Giappone).	1010-060	Piatto non trattato utilizzato nell'incuvazione di C. elegans nel Protocollo 1
IWAKI 35 mm/piatto non trattato	AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Giappone).	1010-035	Piatto non trattato utilizzato nei saggi di locomozione nel Protocollo 3
Milli-Q	Merck, Francia		Acqua ultrapura
Kimwipe S-200	Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Giappone	62020	120 mm x 215 mm; 200 fogli/scatola
WormStuff Worm Pick	Genesee Scientific Corporation, CA, USA)	59-AWP	Raccoglitore di platina specializzato per il prelievo di C. elegans
Sistema di stereomicroscopio di ricerca	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone	SZX16	Micriscopio utilizzato in tutti gli esperimenti e le osservazioni in questo documento
Supporto di messa a fuoco motorizzato per SZX16	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone	SZX2-ILLB	Questo è stato utilizzato per l'osservazione in campo chiaro nel protocollo 3-8.
Obiettivo (&volte; 1)	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone	SDFPLAPO1× PF	NA: 0,15; L.D.: 60 mm. Questo prestito è stato utilizzato per l'osservazione in campo chiaro nel Protocollo 3-8.
Obiettivo (&volte; 2)	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone	SDFPLAPO2XPFC	NA: 0,3; L.D.: 20 mm. Questo  Lends è stato utilizzato per osservazioni di imaging.
Mercury Light Source	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone	U-LH100HG	L'ampio spettro di emissione consente di condurre una serie di esperimenti di imaging a fluorescenza utilizzando tutti i comuni fluorofori.
SZX16 Unità filtro fluorescente (alte prestazioni per YFP)	OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Giappone	SZX2-FYFPHQ	Es: 490-500 nm; Em: 510-560. Questo è stato utilizzato per l'osservazione di immagini della deformazione HBR4.
Fotocamera digitale ad alta velocità EXILIM	CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Giappone		EX-F1 Le Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C e Video 1 sono state ottenute utilizzando questa fotocamera digitale.
Office 2013	Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA		EXCEL Software utilizzato per analisi statistiche