पानी प्रतिधारण के साथ एक अल्ट्रा पतली polydimethylsiloxane microfluidic चिप का उपयोग कर जीवित caenorhabditis एलिगेंस व्यक्तियों के स्थिरीकरण
Summary
स्थिरीकरण विधियों की एक श्रृंखला में पानी प्रतिधारण के साथ एक हाल ही में विकसित अल्ट्रा पतली polydimethylsiloxane microfluidic चिप का उपयोग कर लाइव caenorहैबडिटिस एलिगेंस व्यक्तियों के लक्षित विकिरण की अनुमति देने के लिए स्थापित किया गया है । इस उपंयास पर चिप स्थिरीकरण भी इमेजिंग टिप्पणियों के लिए पर्याप्त है । चिप के विस्तृत उपचार और अनुप्रयोग उदाहरणों को समझाया गया है ।
Abstract
विकिरण व्यापक रूप से जैविक अनुप्रयोगों के लिए और आयन बीम प्रजनन के लिए प्रयोग किया जाता है, और इन विधियों के बीच, microbeam विकिरण सजीव जीवों में रेडियोधर्मी साइटों की पहचान करने का एक शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करता है । इस पत्र में कैनोरहबडिटिस एलिगेंसके जीवित व्यक्तियों के लक्षित माइक्रोबीम विकिरण के लिए विकसित ऑन-चिप स्थिरीकरण विधियों की एक श्रृंखला का वर्णन किया गया है । विशेष रूप से, पॉलीडाइमेथिलसिलॉक्सने (pdms) microfluidic चिप्स है कि हम पहले के लिए anस्थेसिया की आवश्यकता के बिना सी एलिगेंस व्यक्तियों स्थिर विकसित के उपचार में विस्तार से समझाया है । इस चिप, एक कृमि शीट के रूप में संदर्भित, को microfluidic चैनल का विस्तार करने की अनुमति लचीला है, और लोच जानवरों धीरे से ढंक दिया जा करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, PDMS के आत्म अधिशोषण क्षमता के कारण, जानवरों के चैनलों में एक पतली कवर फिल्म है, जिसमें जानवरों संलग्नक के लिए चैनलों में धकेल नहीं रहे है के साथ कीड़ा चादर की सतह को कवर द्वारा सील किया जा सकता है । कवर फिल्म को बंद करके, हम आसानी से जानवरों को इकट्ठा कर सकते हैं । इसके अलावा, कीड़ा चादर पानी प्रतिधारण से पता चलता है और सी एलिगेंस व्यक्तियों जीने की स्थिति के तहत लंबी अवधि के लिए सूक्ष्म अवलोकन के अधीन किया जा करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, चादर केवल ३०० μm मोटी है, जैसे कार्बन आयनों के रूप में भारी आयनों की अनुमति के लिए पशुओं को enclosing चादर के माध्यम से गुजरती हैं, इस प्रकार आयन कणों का पता लगाया जा करने की अनुमति और लागू विकिरण खुराक सही मापा जा करने के लिए । क्योंकि जानवरों को ढकने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली कवर फिल्मों का चयन सफल दीर्घकालिक स्थिरीकरण के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, हमने उपयुक्त कवर फिल्मों के चयन का आयोजन किया और कुछ फिल्मों के बीच एक सिफारिश की है । चिप के एक आवेदन उदाहरण के रूप में, हम कृमि चादर के microfluidic चैनल enclosing जानवरों की पेशी गतिविधियों के इमेजिंग अवलोकन, साथ ही microbeam विकिरण की शुरुआत की । इन उदाहरणों से संकेत मिलता है कि कृमि पत्रकों ने जैविक प्रयोगों की संभावनाओं का काफी विस्तार किया है.
Introduction
एक्स-रे, गामा किरणों, और भारी आयन बीम सहित विकिरण, व्यापक रूप से इस तरह के कैंसर निदान और उपचार में, और आयन बीम प्रजनन के लिए के रूप में जैविक अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है । कई अध्ययनों और तकनीकी विकास वर्तमान में विकिरण के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं1,2,3. सूक्ष्मकिरणपुंज विकिरण सजीव जीवों में रेडियोसंवेदी स्थलों की पहचान करने का एक सशक्तमाध्यम है । क्वांटम और रेडियोलॉजिकल विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए राष्ट्रीय संस्थानों के takasaki उन्नत विकिरण अनुसंधान संस्थान (qst-takasaki) भारी आयन का उपयोग कर सूक्ष्म अवलोकन के तहत व्यक्तिगत कोशिकाओं विकीर्ण करने के लिए एक तकनीक विकसित किया गया है माइक्रोबीम5, और कई मॉडल जानवरों की लक्षित microbeams विकिरण सक्षम करने के लिए विधियों की स्थापना की है, जैसे सूत्रकृमि caenorhabditis एलिगेंस4,6, रेशम के कीड़े7, और oryzias लतीपीज (जापानी मेदका)8. सूत्रकृमि के लक्षित माइक्रोबीम विकिरण सी. एलिगेंस , प्रमुख क्षेत्र में तंत्रिका वलय जैसे विशिष्ट क्षेत्रों के प्रभावी पछाडडाउन की अनुमति देता है, इस प्रकार, चलन जैसी प्रक्रियाओं में इन पद्धतियों की भूमिकाओं को पहचानने में मदद करता है ।
anस्थेसिया की आवश्यकता के बिना सी. एलिगेंस व्यक्तियों के ऑन-चिप स्थिरीकरण के लिए एक विधि माइक्रोबीम विकिरण के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है4. इसके अलावा, microfluidic पिछले4अध्ययन में इस्तेमाल किया चिप्स में सुधार करने के लिए, हम हाल ही में, wettable, आयन-पेनेट्रेशन, polydimethylsiloxane (pdms) microfluidic चिप्स, कृमि शीट्स के रूप में संदर्भित विकसित किया है ( सामग्री की मेजदेखें), के लिए immobilizing C. एलिगेंस व्यक्तियों9. इन अल्ट्रा पतली नरम चादरें (मोटाई = ३०० μm; चौड़ाई = 15 मिमी; लंबाई = 15 मिमी) के साथ एकाधिक (20 या 25) सीधे microfluidic चैनल (गहराई = ७० μm; चौड़ाई = ६० μm या ५० μm; लंबाई = 8 मिमी) में शामिल की सतह (चित्रा 1ए-डी) । microfluidic चैनल खुले हैं और उन्हें एक साथ एक साथ संलग्न किया जा करने के लिए कई जानवरों की अनुमति (चित्रा 1ई). चादरें करने के लिए microfluidic चैनल (द्वारा ~ 10%, चित्रा 1एफ) का विस्तार करने की अनुमति लचीला कर रहे हैं, और लोच जानवरों धीरे से ढंक दिया जा करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, PDMS के आत्म अधिशोषण क्षमता के कारण, जानवरों के चैनलों में एक पतली कवर फिल्म है, जिसमें जानवरों संलग्नक के लिए चैनलों में धकेल नहीं रहे है के साथ कीड़ा चादर की सतह को कवर द्वारा सील किया जा सकता है । कवर फिल्म को बंद करके, हम आसानी से जानवरों को इकट्ठा कर सकते हैं ।
चैनलों के कीड़े जब वे संलग्न किया जा रहा है या जब वे एकत्र कर रहे है चोट नहीं है । इसके अलावा, चादरें PDMS से बना रहे हैं, जो अनिवार्य रूप से hydrophobic है, लेकिन पानी प्रतिधारण सामग्री को hydrophobic प्रदान करके प्राप्त किया जा सकता है । पानी प्रतिधारण और मोटाई कृमि शीट्स के अनुकूल लक्षण हैं । जल-अवधारण क्षमता लंबे समय तक स्थिरीकरण के बाद पशुओं के निर्जलीकरण को रोकती है और दीर्घकालिक टिप्पणियों को निष्पादित करने में सक्षम बनाती है ।
इसके अलावा, के रूप में पहले9वर्णित है, चादरें केवल ३०० μm मोटी हैं, जैसे कार्बन आयनों के रूप में भारी आयनों की अनुमति (पानी में लगभग 1 मिमी की एक सीमा के साथ) के लिए पशुओं enclosing चादर के माध्यम से गुजरती हैं । यह आयन कणों का पता लगाया जा करने के लिए और लागू विकिरण खुराक सही मापा जा करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, कृमि चादरें फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है और इस प्रकार किफायती हैं । पारंपरिक इंजेक्शन विधि के साथ, संलग्न जानवरों को कई बार मर रहे हैं और वे चैनल से बाहर नहीं लिया जा सकता; उनके अंडे भी चैनलों को रोकना कर सकते हैं । इससे चिप अनुपयोगी हो जाती है । चिप्स, इसलिए, मूल रूप से प्रयोज्य है और लागत लाभ अनुपात गरीब है ।
वर्तमान समाचार पत्र में, हम विस्तार से का वर्णन करने के लिए तरीकों की एक श्रृंखला पर लाइव सी. एलिगेंस कीड़ा चादरें का उपयोग कर व्यक्तियों के चिप स्थिरीकरण । पशुओं के चलन assays के माध्यम से 3 ज पर चिप स्थिरीकरण के बाद, हम उपयुक्त कवर फिल्म का मूल्यांकन किया । इसके अलावा, हम दोनों इमेजिंग टिप्पणियों और microbeam विकिरण के लिए पर चिप स्थिरीकरण के उदाहरण दिखाया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक wettable pdms microfluidic चिप का उपयोग कर जीने की स्थिति के तहत सी. एलिगेंस के चिप स्थिरीकरण पर कई जानवरों के कुशल लक्षित microbeam विकिरण सक्षम बनाता है । हैंडलिंग और सुविधाओं को सुखाने से रोकने के लिए इस प्रणाली को न ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने सी. एलिगेंस और डीआरएस के उपचार के संबंध में तरह की सलाह के लिए डॉ. अतसुशी हिगष्टानी का शुक्रिया अदा की । युया हेटटोरी, युइचिरो योकोटा, र यसुहिको कोबायाशी बहुमूल्य छलफल लिए । लेखक C. एलिगेंस और ई.कोलाई के उपभेदों प्रदान करने के लिए caenorhabditis आनुवंशिक केंद्र का शुक्र है । हम qst में tiara के साइक्लोट्रॉन के चालक दल को धंयवाद-takasaki विकिरण प्रयोगों के साथ अपनी तरह की सहायता के लिए । हम इस पांडुलिपि का एक मसौदा संपादन के लिए डॉ Susan Furness धंयवाद । इस अध्ययन के भाग में KAKENHI (अनुदान संख्या JP15K11921 और JP18K18839) JSPS से एमएस के लिए समर्थन किया गया था
Materials
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
Riferimenti
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