Humant Serum Anti-aquaporin-4 immunglobulin G oppdagelsen av cellen-basert analysen

Summary

Cellebasert analysen er en brukte metoden å oppdage serum anti-aquaporin-4 immunglobulin G. Denne metoden kan brukes til klinisk diagnose og vitenskapelige undersøkelser av neuromyelitis optisk spektrum lidelser.

Abstract

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunglobulin G (IgG) er kjernen diagnostiske biomarkør for neuromyelitis optica spektrum lidelser (NMOSD). Cellebasert analysen (CBA) er en mye brukt til å oppdage anti-AQP4 IgG i humant serum med høy sensitivitet og spesifisitet. Kort, serum anti-AQP4 IgG fanges opp av AQP4-transfekterte cellen som er fast på biochip så oppdaget av et fluorescein-merkede sekundære antistoff. Fluorescens mikroskopi er benyttet for å visualisere fluorescensen og intensiteten av fluorescens vurderes ved minst to erfarne klinikere. NMOSD siste diagnosen kan gjøres basert på en kombinasjon av anti-AQP4 IgG søkeresultatene, kliniske manifestasjoner og neuroradiological funn. Ifølge tidligere studier CBA er mer følsom og spesifikk enn andre anti-AQP4 IgG gjenkjenningsmetoder, og det kan brukes til både klinisk diagnose og studier av NMOSD. Metoden har begrensninger; for eksempel mangler fortsatt internasjonal målestokk å evaluere serum anti-AQP4 IgG titers. Her er en detaljert protokoll for humant serum anti-AQP4 IgG oppdagelsen med CBA beskrevet.

Introduction

Serum AQP4 IgG er en kjerne diagnostiske biomarkør for neuromyelitis optica spektrum lidelser (NMOSD)¹. Cellebasert analysen (CBA) er en mye brukt anti-AQP4 IgG gjenkjennings-metoden med høy sensitivitet og spesifisitet. Her er en detaljert protokoll for CBA innført.

AQP4, en vann kanal protein, har seks membran-spenner enheter og to spiralformede domener rundt en vandig pore². Anti-AQP4 IgG er involvert i patogenesen av NMOSD gjennom binding til målet AQP4, som er hovedsakelig lokalisert på endfeet av astrocyttene³. Det har vist at anti-AQP4 IgG er positive i omtrent to tredjedeler av NMOSD pasienter⁴. I de siste internasjonale diagnostiske kriteriene for NMOSD anses anti-AQP4 IgG å være en kjerne diagnostiske biomarkør⁵. I denne forbindelse er det viktig å etablere en protokoll som er pålitelig for å oppdage humant serum anti-AQP4 IgG og tilrettelegge kliniske diagnosen NMOSD.

Foreløpig er ulike anti-AQP4 IgG gjenkjenningsmetoder tilgjengelige, for eksempel CBA, vev-basert analysen, enzym knyttet immunosorbent analysen og flyt cytometri^6,7. CBA benytter EU90 celler, som er transfekterte med menneskelige AQP4, å fange anti-AQP4 IgG. Fanget anti-AQP4 IgG oppdages av fluorescerende sekundære antistoffer og senere visualisert ved mikroskopi. Samler bevis har vist at CBA er mer følsom og spesifikk enn andre anti-AQP4 IgG gjenkjenning metoder^6,7. Ifølge en meta-analyse, sensitivitet og spesifisitet av CBA ble vist å være 76% og 99%, noe som var høyere enn vev-basert og enzym knyttet immunosorbent søk⁶. Videre var en multicenter sammenligning av diagnostiske analyser av anti-AQP4 IgG gjennomført⁷. Totalt 193 studien fag fra 15 europeiske diagnostiske sentre var registrert⁷. Fire forskjellige metoder ble benyttet for å oppdage serum anti-AQP4 IgG⁷. Det ble demonstrert at CBA var mer følsom og spesifikk enn de andre metoder⁷. Som AQP4 uttrykkes som to store isoformene (AQP4-M1 og AQP4-M23), anti-AQP4 IgG fange cellen er transfekterte med AQP4-M1 eller AQP4-M23. Hvilken type fange cellen er imidlertid bedre fortsatt kontroversielt. En undersøkelse har støttet AQP4-M1 basert CBA⁸, mens andre har indikert at AQP4-M23 basert CBA er bedre^7,9,10. AQP4-M23-baserte CBA kan imidlertid gi falske positive resultater på grunn av uspesifikke IgG bindende⁸. Jarius et al. ¹¹ rapporterte at det var ingen signifikant forskjell i anti-AQP4 IgG deteksjon priser mellom AQP4-M1 og AQP4-M23-baserte CBAs.

I sammendraget, serum anti-AQP4 IgG er en kjerne biomarkør for NMOSD. CBA har høyere spesifisitet og følsomhet enn andre anti-AQP4 IgG gjenkjenningsmetoder. Det er fortsatt kontroversielt om AQP4-M1 – eller AQP4-M23-baserte CBA er bedre. I denne artikkelen, er en detaljert protokoll for AQP4-M1-baserte CBA beskrevet, som kan gjelde for klinisk diagnose og studier av NMOSD.

Protocol

Denne fremgangsmåten ble godkjent av den etiske komiteen ved første sykehuset i Jilin universitetet og ble utført på lag 1500 fag. 1. pasient innmelding og blod prøvetaking Bruke laboratorium påvisning av serum anti-AQP4 IgG klinikk pasienter med sjef klager og symptomer nedenfor. Utføre fysiske undersøkelser også.Optisk nevritt: pasienter lider med visuelle underskudd, som tap av visuelle felt og reduksjon i synsskarphet.Akutt myelitis: pasienter kan presentere …

Representative Results

Bruke fremgangsmåten som er beskrevet her, er bestemt anti-AQP4 IgG i serum synlig. Under inngrepet, ble pre fortynnede prøver, en positiv kontroll og en negativ kontroll lagt til feltene reaksjon, som inneholder transfekterte og untransfected områder (figur 2). Fluorescens for negative kontrollen i et transfekterte område angitt hovedsakelig uspesifikke binding av sekundær mot de transfekterte cellene i biochips (Figur 3). …

Discussion

Vi har beskrevet en allment tilgjengelig metode for å oppdage anti-AQP4 IgG i humant serum. Anti-AQP4 IgG er nært knyttet til NMOSD, og etablere en pålitelig anti-AQP4 IgG gjenkjennings-metoden er avgjørende for den kliniske diagnosen NMOSD. Første er anti-AQP4 IgG spesifikke for NMOSD. Multippel sklerose er også en immun-mediert sykdom i sentralnervesystemet og deler mange likheter med NMOSD¹². Anti-AQP4 IgG er imidlertid bare positive i NMOSD¹³. Andre er anti-AQP4 I…

Materials

Anti-aquaporin-4 IIFT	Euroimmun	FA 1128-2005-50	Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.
CellSens Dimension	OLYMPUS	N/A	photograph software
Gel & clot activator tube	Improve medical	623040202	From a local Chinese company