Een muismodel te beoordelen ingeboren immuunreactie op Staphylococcus aureus -infectie
Summary
Een aanpak wordt beschreven voor real-time detectie van de ingeboren immune reactie op het verwonden van cutane en Staphylococcus aureus -infectie van muizen. Door vergelijking LysM-EGFP muizen (die bezitten fluorescerende neutrofielen) met een LysM-EGFP gekruist immunodeficiëntie muis stam, we vooraf ons begrip van de infectie en de ontwikkeling van benaderingen ter bestrijding van de infectie.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) infecties, met inbegrip van methicilline resistente vlekken, zijn een enorme belasting voor de gezondheidszorg. Met de incidentiecijfers van S. aureus -infectie jaarlijks klimmen, is er een vraag voor aanvullend onderzoek in de pathogeniteit. Dierlijke modellen van een besmettelijke ziekte verder van ons begrip van de reactie van de gastheer-pathogeen en leiden tot de ontwikkeling van effectieve therapeutics. Neutrofielen spelen een primaire rol in het aangeboren immuunrespons waarop de S. aureus -infecties wordt beheerd door de vorming van een abces muur van de infectie te vergemakkelijken van bacteriële goedkeuring; het aantal neutrofielen die infiltreren van een S. aureus -huidinfectie vaak correleert met ziekte resultaat. LysM-EGFP muizen, die de verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) ingevoegd in de lysozym M (LysM) promotor regio (uitgedrukt voornamelijk door neutrofiele granulocyten) bezitten, wanneer gebruikt in combinatie met in vivo hele dierlijke fluorescentie imaging (FLI) bieden een middelen voor het kwantificeren van neutrofiele emigratie noninvasively en overlangs in gewonde huid. Wanneer deze wordt gecombineerd met een bioluminescente S. aureus -stam en sequentiële in vivo hele dierlijke bioluminescente afbeeldingen (BLI), is het mogelijk lengterichting volgen zowel de neutrofiele werving dynamiek en in vivo bacteriële belasting op de site van infectie bij narcose muizen vanaf begin van infectie tot resolutie of de dood. Muizen meer resistent zijn tegen een aantal virulentiefactoren geproduceerd door S. aureus die effectieve kolonisatie en infectie bij de mens vergemakkelijken. Immunodeficiëntie muizen bieden een gevoeliger diermodel te onderzoeken persistente S. aureus infecties en de mogelijkheid van therapeutics om aangeboren immuunresponsen stimuleren. Hierin, karakteriseren wij antwoorden in LysM-EGFP muizen die aan MyD88-deficiënte muizen (LysM-EGFP × MyD88– / – muizen) hebben gefokt samen met wild-type LysM-EGFP muizen te onderzoeken van S. aureus huid wondinfectie. Multispectrale simultane detectie studie van neutrofiele werving dynamiek ingeschakeld met behulp van in vivo FLI, bacteriële belasting met behulp van in vivo BLI, en wondgenezing lengterichting en noninvasively na verloop van tijd.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) is goed voor de meerderheid van de huid en weke delen infecties (SSTIs) in de Verenigde Staten1. De incidentie van methicilline-resistente S. aureus (MRSA) infecties gestaag gestegen de afgelopen twee decennia2, de studie van de mechanismen van de persistentie en de ontdekking van nieuwe behandelingsstrategieën motiveren. De standaard van zorg voor MRSA infecties is systemische antibiotische therapie, maar MRSA is geworden tijd3 steeds meer resistent tegen antibiotica en deze drugs kunnen verminderen van de host gunstig microbiome, waardoor negatieve gezondheidseffecten, vooral in kinderen4. Preklinische studies hebben onderzocht alternatieve strategieën voor de behandeling van MRSA infecties5, maar het vertalen van deze benaderingen naar de kliniek heeft bewezen uitdagende als gevolg van de opkomst van Virulentiefactoren die host immuunrespons6dwarsbomen. We combineren om te ontleden de dynamiek van de gastheer-pathogeen dat station S. aureus SSTIs, noninvasive en longitudinale uitlezingen van het aantal neutrofielen gerekruteerd om het bed van de wond met kinetische maatregelen van bacteriële overvloed en wond gebied.
Neutrofielen zijn het meest voorkomende circulerende leukocyten in de mens en de eerste responders om een bacteriële infectie7. Neutrofielen zijn een noodzakelijk onderdeel voor een effectieve host reactie tegen S. aureus infecties als gevolg van hun bactericide mechanismen, met inbegrip van de productie van reactieve zuurstof soorten, proteasen, antimicrobiële peptiden en functionele reacties inclusief fagocytose en neutrofiele extracellulaire val productie8,9. Menselijke patiënten met genetische defecten in neutrofiele functie, zoals Chronische granulomateuze ziekte en syndroom van Chediak-Higashi, tonen een verhoogde gevoeligheid voor S. aureus -infectie. In toevoeging, patiënten met (zoals aangeboren neutropenie) genetische en verworven (zoals neutropenie gezien bij chemotherapie patiënten) gebreken in neutrofiele nummers zijn ook zeer gevoelig voor S. aureus -infectie10. Gezien het belang van neutrofielen in het ontruimen van S. aureus -infecties, kan vergroten hun immuun capaciteit of het afstemmen van hun nummers binnen een S. aureus -laesie blijken een effectieve strategie bij het oplossen van de infectie.
In het afgelopen decennium, zijn transgene muizen met fluorescentie neutrofiele verslaggevers ontwikkeld om te bestuderen van hun handel11,12. Neutrofiele reporter muizen combineren met hele dierlijke beeldvormingstechnieken toelaat Spatio analyse van neutrofielen in weefsels en organen. Wanneer gecombineerd met de bioluminescente stammen van S. aureus, is het mogelijk om bij te houden van de accumulatie van neutrofielen naar aanleiding van S. aureus overvloed en persistentie in het kader van bacteriële virulentie factoren die direct en indirect neutrofiele getallen in aangetast weefsel13,14,15,16erover.
Muizen zijn minder gevoelig voor S. aureus virulentie en immuun belastingontduiking mechanismen dan mensen. Als zodanig, wild-type muizen niet mag zijn een ideale diermodel te onderzoeken van de effectiviteit van een therapeutisch te behandelen chronische S. aureus gegeven infectie. MyD88-deficiënte muizen (dat wil zeggen, MyD88– / – muizen), een stam van immuungecompromitteerde muis die mist functionele interleukin-1 receptor (IL-1R) en Toll-like receptor (TLR) signalering, Toon grotere vatbaarheid voor S. aureus -infectie in vergelijking met wild-type muizen17 en een bijzondere waardevermindering neutrofiele mensenhandel naar een site van S. aureus -infectie van de huid18. Ontwikkeling van de stam van een muis die beschikt over een fluorescerende neutrofiele verslaggever bij MyD88– / – muizen heeft een alternatief model voor het onderzoek naar de werkzaamheid van therapieën voor de behandeling van S. aureus -infectie in vergelijking met huidige neutrofiele reporter muizen.
In dit protocol, we karakteriseren van S. aureus -infectie in de immuungecompromitteerde LysM-EGFP × MyD88– / – muizen, en vergelijk het tijdsverloop en de resolutie van infectie met het LysM-EGFP muizen. LysM-EGFP × MyD88– / – muizen ontwikkelen een chronische infectie die niet wordt opgelost, en 75% bezwijken voor infectie na 8 dagen. Een aanzienlijk gebrek in eerste neutrofiele aanwerving gebeurt meer dan 72 h van de inflammatoire fase van infectie, en 50% minder neutrofielen werven tijdens de laatste fase van de infectie. De verhoogde gevoeligheid van de LysM-EGFP × MyD88– / – muizen maakt dit bijzondere stam een rigoureuze preklinische model te evalueren van de werkzaamheid van nieuwe therapeutische technieken, gericht op van S. aureus -infectie in vergelijking met de huidige modellen gebruik maken van wild-type muizen, met name technieken die zijn gericht op het stimuleren van de aangeboren immuunreactie tegen infectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. aureus -infectie modellen die gebruik maken van bioluminescente S. aureus -infectie in een fluorescerende neutrofiele verslaggever muis in combinatie met geavanceerde technieken van hele dieren in vivo optische beeldvorming hebben onze kennis van de aangeboren geavanceerde immune reactie op de infectie. Eerdere studies met de LysM-EGFP muis hebben aangetoond dat omhoog aan 1 x 107 neutrofielen werven op een S. aureus geïnfecteerde wond gedurende de eerste 24 h van besmetting<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid subsidies R01 AI129302 (voor S.I.S.) en het programma van de opleiding in de farmacologie: van Bench naar Bedside bij UC Davis (NIH T32 GM099608 naar L.S.A). De moleculaire en genomische Imaging (CMGI) bij de Universiteit van Californië-Davis verleend prachtig technologische steun.
Materials
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | .35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -. H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
