Un modèle de souris pour évaluer réponse immunitaire innée à l’infection par Staphylococcus aureus
Summary
Il est décrit une approche pour la détection en temps réel de la réponse immunitaire innée de blessures cutanées et Staphylococcus aureus infection des souris. Par comparaison LysM-EGFP souris (qui possèdent des neutrophiles fluorescents) avec un LysM-EGFP croisés souche de souris immunodéficientes, nous faire avancer notre compréhension de l’infection et l’élaboration d’approches pour lutter contre l’infection.
Abstract
Staphylococcus aureus Les infections (Staphylococcus aureus), y compris les taches résistantes à la méthicilline, sont un énorme fardeau sur le système de santé. Taux d’incidence de l’infection à Staphylococcus aureus grimper chaque année, il y a une demande de recherche supplémentaire dans son pouvoir pathogène. Modèles animaux de maladies infectieuses progresser notre compréhension de la réponse de l’hôte-pathogène et conduisent au développement d’agents thérapeutiques efficaces. Neutrophiles jouent un rôle primordial dans la réponse immunitaire innée qui contrôle les infections à S. aureus en formant un abcès pour mur au large de l’infection et faciliter la clairance bactérienne ; le nombre de neutrophiles qui infiltrent une infection de la peau de S. aureus souvent est corrélée avec le résultat de la maladie. Souris LysM-EGFP, qui possèdent la protéine fluorescente verte (EGFP) renforcée insérée dans la région promotrice de Lysozyme M (LysM) (exprimée principalement par les neutrophiles), lorsqu’il est utilisé en conjonction avec imagerie de fluorescence animaux in vivo (FLI) fournissent une moyens de quantifier émigration neutrophile non invasive et longitudinalement dans la peau blessée. Lorsqu’il est combiné avec un bioluminescentes S. aureus souche et séquentielle imagerie in vivo d’animaux bioluminescent (BLI), il est possible de surveiller longitudinalement la dynamique du recrutement neutrophiles et une charge bactérienne in vivo sur le site de infection chez la souris anesthésiés depuis le début de l’infection à la résolution ou la mort. Les souris sont plus résistants à un certain nombre de facteurs de virulence produites par Staphylococcus aureus qui facilitent la colonisation efficace et infection chez l’homme. Des souris immunodéficientes fournissent un modèle animal plus sensible afin d’examiner les persistants de S. aureus infections et la capacité d’agents thérapeutiques pour stimuler les réponses immunitaires innées. Dans les présentes, nous caractérisons les réponses chez les souris LysM-EGFP ont été élevées à des souris déficientes MyD88 (LysM-EGFP × MyD88– souris/ ) ainsi que des souris de type sauvage LysM-EGFP pour enquêter sur S. aureus infection de plaie cutanée. Détection simultanée multispectrale activé étude de neutrophiles recrutement dynamique à l’aide de FLI in vivo, charge bactérienne à l’aide de BLI in vivo et la cicatrisation longitudinalement et non invasive au fil du temps.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) représente la majorité des infections cutanées et des tissus mous (SSTIs) dans les États-Unis1. L’incidence méthicilline-résistant Staphylococcus aureus (MRSA), les infections a augmenté régulièrement pendant les dernières deux décennies2, motiver l’étude des mécanismes de persistance et de la découverte de nouvelles stratégies de traitement. La norme de soins pour les infections à SARM est une antibiothérapie systémique, mais SARM est devenu plus en plus résistante aux antibiotiques au fil du temps3 et ces médicaments peuvent diminuer le microbiome bénéfique de l’hôte, causant des effets négatifs sur la santé, surtout dans enfants4. Les études précliniques ont examiné des stratégies alternatives pour le traitement d’infections SARM5, mais traduire ces approches à la clinique s’est avérée difficile en raison de l’émergence de facteurs de virulence qui contrecarrent l’hôte des réponses immunitaires6. Pour disséquer la dynamique de l’hôte-pathogène qui animent SSTIs de S. aureus , nous combinons non invasive et afficheurs longitudinales du nombre de neutrophiles recrutement pour le lit de la plaie avec des mesures cinétiques d’abondance bactérienne et plaie zone.
Les neutrophiles sont les leucocytes circulant plus abondant chez les humains et les premiers intervenants à une infection bactérienne7. Les neutrophiles sont une composante nécessaire pour une réponse de l’hôte efficace contre le Staphylococcus aureus infections en raison de leurs mécanismes bactéricides, y compris la production d’espèces réactives de l’oxygène, des protéases, des peptides antimicrobiens et des réponses fonctionnelles y compris la phagocytose et neutrophiles piège extracellulaire production8,9. Les patients humains avec des défauts génétiques en fonction de neutrophile, comme maladie granulomateuse chronique et le syndrome de Chediak-Higashi, montrent une sensibilité accrue aux infections de S. aureus . En outre, les patients avec génétiques (par exemple, neutropénie congénitale) et acquises (par exemple de neutropénie chez les patients de chimiothérapie) défauts en nombre de neutrophiles sont également très sensibles à S. aureus infection10. Compte tenu de l’importance des neutrophiles dans la guérison d’infections à S. aureus , renforçant leurs capacités immunitaires ou réglage leur nombre au sein d’une lésion de S. aureus peut s’avérer une stratégie efficace dans la résolution de l’infection.
Au cours de la dernière décennie, les souris transgéniques avec des journalistes de neutrophiles fluorescence ont été développés pour étudier leur trafic de11,12. Combinant souris journaliste neutrophiles animaux techniques d’imagerie permet l’analyse spatio-temporelle des neutrophiles dans les tissus et organes. Lorsqu’il est combiné avec des souches bioluminescentes de S. aureus, il est possible de suivre l’accumulation de polynucléaires neutrophiles en réponse à l’abondance de S. aureus et de persistance dans le contexte de la virulence bactérienne des facteurs qui directement et indirectement perturber le nombre de neutrophil dans tissu atteint13,14,15,16.
Les souris sont moins sensibles aux mécanismes de S. aureus virulence et immunitaire d’évasion que les humains. Ainsi, souris de type sauvage peuvent ne pas être un modèle animal idéal pour étudier l’efficacité d’une donnée thérapeutique pour traiter les chroniques de S. aureus infection. MyD88-deficient mice (c.-à-d. MyD88– / – souris), une souche de souris immunodéprimées qui n’a pas de récepteurs fonctionnels interleukine 1 (IL-1R) et récepteur Toll-like (TLR) de signalisation, voir la plus grande susceptibilité à l’infection par Staphylococcus aureus , par rapport à souris de type sauvage17 et une altération dans le trafic de neutrophiles vers un site d’infection à S. aureus dans la peau de18. Développement d’une souche de souris qui possède un journaliste neutrophil fluorescent MyD88– / – souris a fourni un modèle alternatif pour enquêter sur l’efficacité des thérapies pour traiter l’infection de S. aureus par rapport à l’actuel neutrophile souris de journaliste.
Dans ce protocole, nous caractériser infection à Staphylococcus aureus dans les LysM-EGFP × MyD88– / – des souris immunodéprimées et comparer l’évolution temporelle et la résolution de l’infection par les souris LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88– / – souris développent une infection chronique qui ne se résout pas, et 75 % succombent à une infection après 8 jours. Un défaut important de recrutement initial de neutrophil produit sur une période de 72 h de la phase inflammatoire de l’infection, et moins de 50 % de polynucléaires neutrophiles recruter au cours de la dernière étape de l’infection. La sensibilité accrue du × LysM-EGFP MyD88 souris– / – cela rend notamment la souche un modèle préclinique rigoureux pour évaluer l’efficacité des nouvelles techniques thérapeutiques ciblant les S. aureus infection par rapport à l’actualité des modèles utiliser la souris de type sauvage, en particulier les techniques visant à stimuler la réponse immunitaire innée contre l’infection.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modèles d’infection de S. aureus qui utilisent la bioluminescence S. aureus infection chez une souris journaliste neutrophiles fluorescent en conjonction avec des techniques avancées d’imagerie optique in vivo animaux ont fait progresser notre connaissance de l’inné réponse immunitaire à l’infection. Des études antérieures à l’aide de la souris LysM-EGFP ont montré que vers le haut à 1 x 107 neutrophiles recrue d’une plaie infectée de Staphylococcus aureus dans…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National instituts de santé subventions R01 AI129302 (à S.I.S.) et le programme de formation en pharmacologie : du laboratoire au patient à UC Davis (NIH T32 GM099608 à la plaque). Le moléculaire et imagerie génomique (CMGI) à l’Université de Californie à Davis fourni un appui technologique superbe.
Materials
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | .35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
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