Un approccio è descritto per la rilevazione in tempo reale della risposta immunitaria innata di ferite cutanee e Staphylococcus aureus infezione dei topi. Di confronto LysM-EGFP topi (che possiedono i neutrofili fluorescenti) con un LysM-EGFP incrociate topo immunodeficiente, abbiamo anticipato la nostra comprensione dell'infezione e lo sviluppo di approcci per combattere l'infezione.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un modello di topo per valutare risposta immunitaria innata per infezione da Staphylococcus aureus
In questo articolo
Sommario
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) infezioni, compresi meticillina resistente alle macchie, sono un enorme onere per il sistema sanitario. Con tassi di incidenza di infezione da Staphylococcus aureus arrampicata annualmente, c'è una domanda per ulteriori ricerche nelle sua patogenicità. Modelli animali di malattia infettiva avanzano la nostra comprensione della risposta ospite-patogeno e portano allo sviluppo di terapie efficaci. I neutrofili svolgono un ruolo primario nella risposta immunitaria innata che controlla le infezioni da S. aureus formando un ascesso per muro fuori l'infezione e facilitare lo spazio batterico; il numero dei neutrofili che infiltrarsi un'infezione della pelle di S. aureus spesso correla con risultato di malattia. Topi LysM-EGFP, che possiedono la proteina fluorescente verde avanzata (EGFP) inserita nella regione del promotore di lisozima M (LysM) (espressa principalmente dai neutrofili), quando utilizzato in combinazione con imaging in vivo animale intero fluorescenza (FLI) forniscono un mezzi di quantificazione del neutrofilo emigrazione non invadente e longitudinalmente in pelle ferita. Quando combinato con un bioluminescenti Staphylococcus aureus strain e sequenziale in vivo imaging intero animale bioluminescente (BLI), è possibile monitorare longitudinalmente sia le dinamiche di reclutamento dei neutrofili e la carica batterica in vivo presso il sito di infezione nei topi anestetizzati dall'inizio dell'infezione alla risoluzione o alla morte. I topi sono più resistenti a una serie di fattori di virulenza prodotta da S. aureus che facilitano efficace colonizzazione e l'infezione in esseri umani. Topi immunodeficienti forniscono un modello animale più sensibile per esaminare persistente S. aureus infezioni e la possibilità di terapeutica per amplificare la risposta immune innata. Nel presente documento, ci caratterizzano le risposte in topi LysM-EGFP che sono stati allevati per topi MyD88-carenti (LysM-EGFP × MyD88- / - topi) insieme con selvaggio-tipo LysM-EGFP topi per indagare lo Staphylococcus aureus pelle infezione della ferita. Rilevazione simultanea multispettrali abilitato studio delle dinamiche di reclutamento dei neutrofili utilizzando in vivo FLI, carica batterica utilizzando BLI in vivo e cicatrizzazione longitudinalmente e non invadente nel corso del tempo.
Introduzione
Staphylococcus aureus (S. aureus) rappresenta la maggior parte della pelle e infezioni dei tessuti molli (SSTI) in Stati Uniti d'America1. L'incidenza di meticillino-resistenti Staphylococcus aureus (MRSA) infezioni è aumentato costantemente sopra il passato due decenni2, motivare lo studio dei meccanismi di persistenza e la scoperta di nuove strategie di trattamento. Lo standard di cura per le infezioni da MRSA è la terapia antibiotica sistemica, ma MRSA è diventato sempre più resistente agli antibiotici nel corso tempo3 e questi farmaci possono diminuire microbiome ben....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli studi del topo sono stati esaminati e approvati dal comitato di uso presso UC Davis e istituzionali Animal Care e sono state eseguite secondo le indicazioni dell'Animal Welfare Act e la legge di estensione di ricerca salute. Assicurarsi di utilizzare guanti sterili quando si lavora con gli animali.
1. mouse fonte e custodia
- Derivare LysM-eGFP topi su una priorità bassa genetica C57BL/6J come descritto in precedenza12. Derivare LysM-EGFP × MyD88- / - topi da incrocio topi LysM-EGFP con MyD88- / - topi su uno sfondo di C57BL/6J.
- Mouse della casa in un vivaio. Per ques....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
LysM-EGFP × MyD88- / - topi sono più suscettibili di infezione da S. aureus che topi LysM-EGFP
Il ceppo di S. aureus utilizzato in questo studio, ALC290618, è stato costruito con un plasmide contenente il costrutto di lux che produce segnali bioluminescenti da batteri vivi e attivamente metabolizzante. Quando inoculate nei topi, bioluminescenza in vivo (BLI) tec.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Modelli di infezione di S. aureus che utilizzano bioluminescenti S. aureus infezione in un mouse fluorescente del neutrofilo reporter in combinazione con tecniche avanzate di animale intero in vivo imaging ottico hanno avanzato la nostra conoscenza dell'innata risposta immunitaria all'infezione. Utilizzando il mouse LysM-EGFP gli studi precedenti hanno indicato che fino a 1 x 107 neutrofili recluta per una ferita infetta di S. aureus sopra le prime 24 ore dell'infezione
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Lloyd S. Miller ha ricevuto sovvenzioni dalla MedImmune, Pfizer, Regeneron e Chan Soon-Shiong Nanthealth Foundation e consulenza tasse da Noveome Biotherapeutics e la Fondazione di Nanthealth Chan Soon-Shiong che non sono correlati al lavoro segnalato in questa carta. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da nazionale istituti di salute sovvenzioni R01 AI129302 (al s.i.s.) e il programma di formazione in farmacologia: da banco al capezzale presso UC Davis (NIH T32 GM099608 a Silvana). Il molecolare e Imaging Genomic (CMGI) presso la University of California Davis fornito eccellente supporto tecnologico.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta a fondo tondo in polipropilene da 14 mL | Falcon | 352059 | |
| Punzone per biopsia monouso da 6 mm | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescente S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Agar di sangue bovino, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine cloridrato iniettabile | Western Medical Supply | 7292 | 0,3 mg/mL |
| C57BL/6J Topi | Jackson Labratory | 000664 | |
| cloramfenicolo (polvere cristallina) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Siringhe per insulina | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0,35 mm (28 g) x 12,7 mm (1/2'') |
| Sistema di imaging in vivo con spettro IVIS | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software Serie IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff, Albert Einstein College di New York. | ||
| Spettrofotometro per microvolumi | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Topi | Jackson Labratory | 009088 | |
| Spugne non tessute | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Soluzione di iodio povidone 10% | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad | Software License | |
| Brodo di soia trittico | Becton, Dickson and Company | 211825 |
Riferimenti
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
