En utilisant en forme in Vitro et dans les cellules d’enquêter sur petites molécules a induit des changements structurels de l’ARN pré-messager
Summary
Des protocoles détaillés pour les deux in vitro et dans les cellules sélectif 2′-hydroxyle acylation analysés par des expériences de primer extension (forme) pour déterminer la structure secondaire des séquences de l’ARN pré-messager d’intérêt en présence d’une petite molécule RNA ciblage sont présenté dans cet article.
Abstract
Dans le processus de développement de médicaments de RNA-ciblant les petites molécules, élucider les modifications structurelles lors de leurs interactions avec les séquences d’ARN cible est souhaitée. Nous fournissons ci-après une détaillées in vitro et dans les cellules sélectif 2′-hydroxyle acylation analysés par extension d’amorce protocole (forme) pour étudier le changement structurel de RNA en présence d’un médicament expérimental pour l’atrophie musculaire spinale (SMA), la survie de des motoneurones (SMN)-C2 et dans l’exon 7 du pré-ARNm du gène SMN2. En forme in vitro, une séquence d’ARN de 140 nucléotides contenant SMN2 exon 7 est transcrits par l’ARN polymérase T7, pliée en présence de SMN-C2 et modifiée par la suite par un réactif d’acylation doux 2′-OH, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Cet adduit 2′-OH-NAI est encore sondé par un 32extension d’amorce marquée P et résolu par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). À l’inverse, 2′-OH acylation en forme dans les cellules a lieu in situ avec SMN-C2 lié ARN cellulaire dans les cellules vivantes. La séquence de l’ARN pré-messager de l’exon 7 dans le gène SMN2, ainsi que des mutations dans l’extension de l’amorce, induite par la forme a été ensuite amplifiée par PCR et sous réserve de séquençage de prochaine génération. Si l’on compare les deux méthodes, forme in vitro est une méthode plus rentable et ne nécessite pas de puissance de calcul pour visualiser les résultats. Toutefois, le modèle in vitro de RNA dérivées de SHAPE s’écarte parfois de la structure secondaire dans un contexte cellulaire, probablement en raison de la perte de toutes les interactions avec les protéines de liaison à l’ARN. Dans les cellules forme n’a pas un milieu de travail matériel radioactif et donne une structure secondaire plus précise de RNA dans le contexte cellulaire. En outre, la forme dans les cellules est généralement applicable pour une plus grandes séquences de gamme de l’ARN (~ 1 000 nucléotides) en utilisant le séquençage de nouvelle génération, par rapport à in vitro façonnent (~ 200 nucléotides) qui habituellement s’appuie sur l’analyse de PAGE. Dans le cas de l’exon 7 SMN2 pre-mRNA, la forme in vitro et dans les cellules dérivées des modèles RNA sont semblables les uns aux autres.
Introduction
Acylation sélective 2′-hydroxyle analysée par extension d’amorce (SHAPE) est une méthode de mesure de la cinétique de chaque nucléotide dans une séquence d’ARN d’intérêt et élucider la structure secondaire à mononucléotidiques résolution1. Méthodologies de forme, tant en conditions in vitro2,3,4 (l’ARN purifié dans un système tampon définie) et dans la vie des cellules de mammifères5,6, ont été développées afin d’étudier l’enseignement secondaire structure des séquences de longueur moyenne RNA (typiquement < 1 000 nucléotides de forme dans les cellules et < 200 nucléotides pour forme in vitro). Il est particulièrement utile pour évaluer les changements structurels dans le récepteur RNA lors de la liaison à RNA-interaction petite molécule métabolites2,4,,7,8 et d’étudier les actions mécaniques des molécules ciblant les RNA au cours de la drogue le développement9,,10.
Découverte de médicaments ciblant les RNA a récemment attiré l’attention dans des laboratoires universitaires et l’industrie pharmaceutique11,12 via différentes approches et stratégies13,14,15 ,16. Exemples récents de ciblage RNA de petites molécules pour l’usage clinique notamment deux médicaments expérimentaux structurellement distinctes, LMI-07017 et18,RG-791619, pour l’atrophie musculaire spinale (SMA), qui a montré prometteur résultats de la phase II des essais cliniques20. Les deux molécules ont démontré que la survie des motoneurones (SMN) cible 2 pré-ARNm et réguler le processus d’épissage du gène SMN26,17,21. Nous avons démontré antérieurement à l’application de l’in vitro et forme dans les cellules par un examen des changements structurels en présence d’un analogue de RG-7916 appelée SMN-C26ARN cible.
En principe, forme mesure le taux de l’acylation de 2′-OH de chaque nucléotide d’une séquence d’ARN en présence de quantités excessives d’un réactif d’acylation auto extinction de manière impartiale. Le réactif d’acylation n’est pas stable dans l’eau, avec une courte demi-vie de (par exemple, T1/2 = 17 s 1-méthyl-7-nitroisatoic anhydride ; ou 1 M 7, environ 20 min pour 2-methylnicotinic acid imidazolide, NAI)22 et une insensibilité à l’identité de les bases23. Il en résulte une acylation plus favorable des groupes de base, souple, qui peut être transformé en une évaluation précise de la dynamique de chaque nucléotide 2′-OH. Plus précisément, un nucléotide dans une paire de base est généralement moins réactif qu’un non apparié à un réactif de modificateurs de 2′-OH, comme NAI et 1 M 7.
En regardant la source du modèle RNA, et où s’effectue l’acylation de la 2′-OH, forme peut généralement être classé en forme in vitro et dans les cellules. Dans des utilisations de vitro forme purifiée T7 transcrit RNA et ne dispose pas d’un contexte cellulaire dans des modèles expérimentaux. En forme dans les cellules, la transcription de l’ARN modèle et acylation de la 2′-OH se produisent dans des cellules vivantes ; par conséquent, les résultats peuvent récapituler le modèle structurel de RNA dans un contexte cellulaire. FORME dans les cellules a été mentionnée comme dans vivo forme pour la forme dans les cellules vivantes dans la littérature24. Étant donné que cette expérience n’est pas effectuée chez un animal, nous avons appelé cette expérience forme dans les cellules pour une précision.
Les stratégies pour la phase d’extension amorce de forme in vitro et dans les cellules sont également différentes. En forme in vitro, transcription inverse s’arrête à la position 2′-OH de l’acylation en présence de Mg2 +. Une extension d’amorce de 32P-labled apparaît donc comme une bande dans l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) et l’intensité de la bande est proportionnelle à l’acylation taux1. En forme dans les cellules, transcription inverse génère des mutations aléatoires à la 2′-OH adduit position en présence de Mn2 +. Le taux de mutation de chaque nucléotide peut être capturé par séquençage de prochaine génération de profondeur, et la réactivité forme mononucléotidiques résolution peut alors être calculée.
Un problème potentiel pour la forme dans les cellules est le rapport signal-bruit faible (c.-à-d., une majorité des groupes 2′-OH est non modifiée, alors que les séquences non modifiées occupent la plupart de la lire dans le séquençage de nouvelle génération). Récemment, une méthode pour enrichir la 2′-OH modifié RNA, visé comme en vivo, cliquez sur la forme (icSHAPE), a été développée par le laboratoire de Chang25. Cette méthode d’enrichissement peut être avantageuse, dans l’étude de faibles petites molécules telles que les interactions de RNA, surtout dans un interrogatoire à l’échelle du transcriptome.
Protocol
Representative Results
Discussion
En forme in vitro, il est essentiel d’utiliser le descripteur d’ARN homogène de haute qualité. T7 transcription, cependant, donne souvent des séquences hétérogènes36. Surtout, séquences avec ±1 nucléotides à l’extrémité 3′ avec des rendements non négligeable36 sont généralement difficiles à enlever par purification sur gel de polyacrylamide. Descripteur d’ARN hétérogène peut entraîner plus d’un jeu du signal dans le profilage de gel de séquen?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été rendu possible par l’octroi de NIH R01 (NS094721, K.A.J.).
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
Riferimenti
- Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
- Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
- Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
- Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
- Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
- Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
- Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
- Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
- Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
- Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
- Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
- Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
- Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
- Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
- Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
- Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
- Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
- Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
- Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
- Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
- Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
- Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
- Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
- Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
- Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
- Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
- Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
- Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
- Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
- Qi, H., et al. . Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
- Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
- Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
- Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
- Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).
