MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには
Summary
RNA を対象とした小分子の存在下で興味の mRNA シーケンスの二次構造を決定するプライマー拡張 (形状) を用いて分析両方生体外でそして細胞の選択的 2′-水酸基のアシル化の詳細なプロトコルします。この記事で紹介しました。
Abstract
RNA を対象とした低分子化合物の医薬品開発の過程でターゲット RNA シーケンスとの相互作用によって構造変化の解明が望まれます。我々 ここの提供、詳細な体外とセルの選択 2′ ヒドロキシル アシル化はプライマー拡張によって脊髄性筋萎縮症 (SMA) の生存の実験的な薬の存在下で RNA の構造変化を研究する (形状) プロトコル分析運動ニューロン (SMN)-C2 と SMN2 遺伝子の mRNA のエクソン 7。体外形 SMN2 エクソン 7 を含む 140 のヌクレオチドの RNA シーケンスは T7 RNA ポリメラーゼによる転写、召-C2 の存在下で折り返されているおよび軽度 2′-ああアシル化試薬 2-methylnicotinic 酸 imidazolide (NAI) によって後で変更します。この 2′-オハイオ-NAI 付加がさらに32P 標識プライマー拡張による、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) による解決。逆に、細胞の形で 2′-オハイオ州のアシル化では、細胞が召 C2 バインド細胞 RNA をその場で行われます。PCR と次世代シーケンスが、形状による突然変異のプライマー拡張と共に、SMN2 遺伝子のエクソン 7 の mRNA シーケンスはそれから増幅されます。2 つの手法を比較すると、体外の形状はよりコスト効果の高い方法で、結果を可視化する計算力を必要としません。ただし、in vitro RNA の SHAPE 派生モデルは、RNA 結合タンパク質とのすべての相互作用の損失の可能性が高いため、携帯電話のコンテキストの二次構造から逸脱するが時々。セルの形状は放射性物質職場を必要としないし、携帯電話のコンテキストでより正確な RNA 二次構造が得られます。さらに、細胞の形状は通常適用体外に比べると次世代シーケンサーを利用してより大きな範囲の RNA シーケンス (~ 1,000 ヌクレオチド) 形状 (~ 200 のヌクレオチド)、通常のページの分析に依存しています。SMN2 mRNA のエクソン 7 の in vitro およびセル内の図形が派生した場合に備えて RNA モデルは互いに似ています。
Introduction
プライマー拡張 (形状) を用いて選択 2′-水酸基のアシル化は、興味の RNA シーケンス中の各ヌクレオチドの動態を測定し、単一ヌクレオチド分解能1二次構造の解明の方法です。図形の方法論の in vitro 条件2,3,4 (定義されたバッファー システムで浄化された RNA) の両方生きている哺乳類セル5,6セカンダリを調査するために開発されています。中程度の長さの RNA シーケンスの構造 (通常 < セル内の図形の 1,000 ヌクレオチドと < 体外形の 200 のヌクレオチド)。これは RNA と相互作用する低分子代謝物2,4,7,8が結合する受容体 RNA の構造変化を評価し、機械的操作の研究特に便利RNA を対象とした薬剤開発9,10中分子。
RNA を対象とした創は、異なるアプローチと戦略13,14,15 を介して、大学の研究室で注目と製薬業界11,12を最近集めています。、16。臨床使用のための小さい分子の RNA を対象とした最近の例は、2 つの構造的に異なる実験薬、LMI 07017 , RG 791618,19、脊髄性筋萎縮症 (SMA)、約束を示したフェーズ II 臨床試験20の結果。両方の分子が 2 mRNA ターゲット生存運動ニューロン (SMN) の実証し、SMN2 遺伝子6,17,21のスプライシング プロセスを調節します。以前、体外との RG-7916 召 C26として知られているアナログの存在下で標的 RNA の構造変化の検討でセルに図形の応用を示した。
原則として、図形は公平な方法で過剰自己クエンチング アシル化試薬の存在下での RNA シーケンスの各ヌクレオチドの 2′-オハイオ州のアシル化率を測定します。アシル化試薬はの短い半減期の水で、安定しない (例えば、 T1/2 = 17; 1-メチル-7-nitroisatoic 無水または 1 M 7、2 methylnicotinic 酸 imidazolide 〜 20 分または NAI の s)22とのアイデンティティへの鈍感拠点23。各ヌクレオチドのダイナミクスの正確な評価に変換することができます柔軟な拠点の 2′-オハイオ州のグループのより有利なアシル化でこの結果します。具体的には、塩基対の塩基配列が通常ないなど 1 M 7 の 2′-ああ変更試薬に対になっていないものに比べて反応が弱い。
RNA テンプレートおよび 2′-オハイオ州のアシル化が起こるのソースを見て、形状一般的に in vitro およびセル内の図形に分類することができます。培養形状を使用して精製 T7 RNA の転写し、実験デザインで携帯電話コンテキストを欠いています。セルの形で RNA テンプレート転写と 2′-オハイオ州のアシル化の両方の生きている細胞内で発生します。したがって、結果は細胞における RNA の構造モデルを要約することができます。セルの形状生体形状のように文学24の生きているセルに図形の呼ばれています。この実験は動物では実行されない、ため精度のセルに図形としてこの実験私たちと呼ばれます。
In vitro およびセル内の図形のプライマー拡張段階の戦略も異なっています。体外形で逆のトランスクリプションは Mg2 +の存在下で 2′-オハイオ州のアシル化の位置で停止します。32P 標識プライマー拡張したがってポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) のバンドとして表示されます、バンドの強度はアシル化率1に比例します。セルの形で逆のトランスクリプションは、2′-オハイオ州でのランダムな突然変異を生成します Mn2 +の存在下での位置を付加します。各塩基の変異率は深さ次世代シーケンシングのでキャプチャできるし、塩基の分解能で形反応性が計算できます。
セル内の図形の潜在的な問題が低信号対雑音比 (すなわち、2′-オハイオ州のグループの大半は修正されていない、変更されていないシーケンスは、次世代シーケンシングの読み取りの大部分を占めている間)。最近、2′ オハイオ州を豊かにする方法は、RNA を変更、生体内と同様に形状 (icSHAPE) をクリックすると呼ばれるチャン研究所25によって開発されました。この濃縮法は弱い小分子 RNA 相互作用、特にトランスクリプトーム尋問などの研究に有利であるかもしれない。
Protocol
Representative Results
Discussion
体外形で質の高い均一な RNA テンプレートを使用するが重要です。しかし、T7 転写、しばしば異種シーケンス36が得られます。特に、非取るにたらない利回り36と 3′ 末端に ± 1 ヌクレオチドのシーケンスは、通常ポリアクリルアミド ゲルの浄化による除去が困難。異種の RNA テンプレートは、時々 難しく結果を解釈するプライマー拡張製品のシーケンス ゲ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH R01 グラント (NS094721、K.A.J.) によって可能になった。
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
Riferimenti
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