Bruke i Vitro og i celle form å undersøke små molekyl indusert Pre-mRNA strukturelle endringer
Summary
Detaljert protokoller for både in vitro og i celle selektiv 2-hydroksyl acylation analysert av primer forlengelsen (SHAPE) eksperimenter for å finne den sekundære strukturen i pre-mRNA sekvenser av interesse i nærvær av et RNA målretting små molekyl er presentert i denne artikkelen.
Abstract
Under stoffet utviklingen av RNA målretting små molekyler, er Klargjørende strukturelle endringer på deres samhandling med målet RNA sekvenser ønsket. Vi gi her et detaljert i vitro og i celle selektiv 2-hydroksyl acylation analysert av primer (SHAPE) protokollen for å studere RNA strukturelle endringen i nærvær av en eksperimentell narkotikabruk for spinal muskel atrofi (SMA), overlevelse av motoriske nervecellen (SMN)-C2, og i ekson 7 av pre-mRNA av SMN2 genet. I vitro form, er en RNA sekvens av 140 nukleotider inneholder SMN2 ekson 7 transkribert av T7 RNA polymerase, foldet i nærvær av SMN-C2 og senere endret av en mild 2-OH acylation reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Denne 2-OH-NAI adduct er videre undersøkt av en 32P-merket primer utvidelse og løses av polyakrylamid gel geleelektroforese (side). Omvendt, 2-OH acylation i i celle form foregår i situ med SMN-C2 bundet mobilnettet RNA i levende celler. Pre-mRNA sekvensen av ekson 7 i SMN2 genet, sammen med form-indusert mutasjoner i primer forlengelsen, ble deretter forsterkes av PCR med neste generasjons sekvensering. Sammenligne de to metodikkene, i vitro FIGUREN er en mer kostnadseffektiv metode og krever ikke kraften til å visualisere resultatene. Men avviker i vitro figur-avledet RNA modellen noen ganger fra den sekundære strukturen i en mobilnettet sammenheng, sannsynligvis på grunn av alle interaksjoner med RNA-bindende proteiner. I celle FIGUREN trenger ikke en radioaktivt materiale arbeidsplass og gir en mer nøyaktig RNA sekundære struktur i mobilnettet sammenheng. Videre i celle FIGUREN er vanligvis tilgjengelig for et større utvalg av RNA sekvenser (~ 1000 nukleotider) ved å benytte neste generasjons sekvensering, sammenlignet med i vitro form (~ 200 nukleotider) som vanligvis er avhengig av side analyse. I tilfelle av ekson 7 i SMN2 pre-mRNA, in vitro og i celle FIGUREN avledet er RNA modeller lik hverandre.
Introduction
Selektiv 2-hydroksyl acylation analysert av primer (SHAPE) er en metode for å måle the kinetics av hver nucleotide i en RNA sekvens av interesse og Klargjørende sekundære strukturen på enkelt-nukleotid løsning1. FIGUR metoder, begge i i vitro forhold2,3,4 (renset RNA i et definert buffer system) og i levende pattedyrceller5,6, er utviklet for å undersøke sekundære strukturen til middels lengde RNA sekvenser (vanligvis < 1000 nukleotider for i celle figur og < 200 nukleotider for i vitro figur). Det er spesielt nyttig å evaluere strukturelle endringer i reseptor RNA ved binding til RNA-samspill små molekyl metabolitter2,4,7,8 og studere mekanistisk handlinger målretting RNA molekyler i narkotika utvikling9,10.
RNA målretting stoffet funnet har nylig trukket oppmerksomheten i akademiske laboratorier og farmasøytisk industri11,12 via ulike tilnærminger og strategier13,14,15 ,16. Siste eksempler RNA målretting små molekyler for klinisk bruk på to strukturelt distinkte eksperimentelle narkotika, LMI-07017 og RG-791618,19, for spinal muskel atrofi (SMA), som viste lovende resultater i fase II kliniske studier20. Begge molekyler ble demonstrert for målet overlevelse av motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA og regulere skjøting prosessen SMN2 genet6,17,21. Vi viste tidligere anvendelse av i vitro og i celle figur i en undersøkelse av målet RNA strukturelle endringer i nærvær av en analog av RG-7916 kjent som SMN-C26.
I prinsippet måler figur 2-OH acylation hver nucleotide i en RNA sekvens i nærvær av overflødig mengder en selv slukke acylation reagens på en saklig måte. Acylation reagensen er ikke stabil i vann, med en kort halveringstid av (f.eks T1/2 = 17 s 1-methyl-7-nitroisatoic anhydride; eller 1 M 7 ~ 20 min til 2-methylnicotinic acid imidazolide eller NAI)22 og insensitivitet identitet baser23. Dette resulterer i en mer gunstige acylation av 2-OH gruppene med fleksible baser, som kan forvandles til en nøyaktig vurdering av dynamikken i hver nucleotide. Spesielt er en nucleotide i en base-par vanligvis mindre reaktiv enn et kort til en 2-OH endring reagens, som NAI og 1 M 7.
Ser på kilden til malen RNA og hvor 2-OH acylation foregår, kan figur generelt kategoriseres i in vitro og i celle form. I vitro FIGUREN bruker renset T7 transkribert RNA og mangler en mobilnettet sammenheng i eksperimentell design. I celle form forekommer både RNA mal transkripsjon og 2-OH acylation i levende celler. resultatene kan derfor recapitulate RNA strukturelle modellen i en mobilnettet sammenheng. I celle FIGUREN har blitt referert til som vivo form for FIGUREN i levende celler i litteratur24. Siden dette eksperimentet ikke utføres i en dyr, kalte vi dette eksperimentet som i celle figur for nøyaktighet.
Strategier for primer forlengelsen stadium av in vitro og i celle FIGUREN er også forskjellig. I vitro form stopper omvendt transkripsjon på 2-OH acylation posisjon i nærvær av Mg2 +. Filtypen 32P-merket primer derfor vises som et band i polyakrylamid gel geleelektroforese (side) og intensiteten av bandet er proporsjonal med den acylation rate1. I celle form, omvendt transkripsjon genererer tilfeldige mutasjoner på 2-OH adduct posisjon i nærvær av Mn2 +. Mutational frekvensen av hver nucleotide kan bli slått av i dybden neste generasjons sekvensering, og FIGUREN reaktivitet med enkelt-nukleotid oppløsning kan deretter beregnes.
Et problem for i celle figur er lav signal-til-støy forholdet (dvs. et flertall av de 2-OH er uendret, mens uforandret sekvensene opptar mesteparten av lese i neste generasjons sekvensering). Nylig en metode for å berike 2-OH endret RNA, referert til som vivo klikker figur (icSHAPE), ble utviklet av Chang laboratorium25. Denne berikelse metoden kan være en fordel i å studere svak små molekyler som RNA samspill, spesielt i en transcriptome hele avhør.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vitro form er det avgjørende å bruke høykvalitets homogen RNA mal. T7 transkripsjon, men gir ofte heterogene sekvenser36. Spesielt er sekvenser med ±1 nukleotid på 3-terminus med ikke-ubetydelig gir36 vanligvis vanskelig å bli fjernet av polyakrylamid gel rensing. Heterogen RNA mal kan resultere i mer enn ett sett av signalet i sekvensering gel profilering av primer utvidelse produktet, som noen ganger gjør det vanskelig å tolke resultatet. Ribozyme på begge 5′- …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble gjort mulig ved NIH R01 tilskudd (NS094721, K.A.J.).
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
Riferimenti
- Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
- Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
- Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
- Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
- Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
- Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
- Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
- Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
- Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
- Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
- Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
- Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
- Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
- Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
- Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
- Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
- Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
- Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
- Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
- Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
- Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
- Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
- Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
- Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
- Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
- Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
- Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
- Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
- Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
- Qi, H., et al. . Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
- Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
- Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
- Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
- Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).
