Fraccionamiento de la célula de las células U937 en ausencia de centrifugación de alta velocidad
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para aislar la membrana plasmática, citoplasma y mitocondrias de las células U937 sin el uso de la centrifugación de alta velocidad. Esta técnica se puede utilizar para purificar fracciones subcelulares para la examinación subsecuente de la localización de la proteína mediante immunoblotting.
Abstract
Este protocolo nos detalladamente un método para obtener fracciones subcelulares de las células U937 sin el uso de ultracentrifugación o indiscriminadas detergentes. Este método utiliza buffers hipotónicas, digitonin, lisis mecánica y centrifugación diferencial para aislar el citoplasma, mitocondrias y membrana plasmática. El proceso puede escalarse para satisfacer las necesidades de los investigadores, es barato y sencillo. Este método permitirá a los investigadores a determinar la localización de la proteína en células sin centrífugas especializadas y sin el uso de kits comerciales, los cuales pueden ser prohibitivos. Hemos utilizado con éxito este método para separar citosólica, membrana del plasma y proteínas mitocondriales en la línea de celular del monocito humana U937.
Introduction
Identificación confiable de la localización de la proteína es a menudo necesaria al examinar vías moleculares en las células eucariotas. Métodos para obtener fracciones subcelulares son utilizados por los investigadores a examinar más de cerca los componentes celulares de interés.
La mayoría de los métodos de fraccionamiento celular existentes cae generalmente en dos amplias categorías, a base de detergente1,2 y basado en la ultracentrifugación3,4,5, que puede ser diferenciados por la velocidad, precisión y costo. Detergentes basado en protocolos se basan en el uso de buffers con el aumento de fuerza detergente para solubilizar componentes distintos de la célula. Este es un método rápido y conveniente para el procesamiento de las muestras y puede ser rentable si el número y tamaño de las muestras son pequeñas. Base de detergente kits pueden comprarse para aislar citoplásmico membrana/organelo (fracción mixta) y fracciones nucleares de las células. Sin embargo, varios inconvenientes asociados con estos kits de limitan su utilidad a los investigadores. Están diseñados para aislar fácilmente uno o dos componentes de la célula, pero son incapaces de aislar todas las fracciones de una muestra al mismo tiempo. El uso de detergentes hace que la membrana plasmática y los organelos de membrana-incluido va ser solubilizados igualmente y, por tanto, no pueden ser separados uno del otro. Una complicación adicional surge de los componentes patentados en estos kits que impide que los investigadores alterar condiciones para aplicaciones específicas. Por último, ellos están limitados en número de aplicaciones y pueden ser prohibitivos para los experimentos de escala más grandes. Kits base detergente no existen para el aislamiento de mitocondrias, sin embargo, no están diseñados para aislar la membrana del plasma y el rendimiento de la muestra es significativamente menor que el de centrifugación de densidad basado en protocolos de aislamiento6,7 .
Métodos que utilizan ultracentrifugación para obtener fracciones son más tiempo consumiendo, pero a menudo resultado en fracciones más que kits de detergente. Para aislar las membranas del plasma de las células sin primero solubilizando los (dando por resultado la contaminación con organelos de membrana) obliga a la lisis por un método sin detergente seguido de separación de componentes celulares mediante diferencial centrifugación, con aislamiento de membrana plasmática que requieren velocidades de 100.000 × g para llevar a cabo. En muchos casos, debe seguirse diferencial centrifugación isopicnica centrifugación gradiente de densidad para más separación de fracciones celulares o eliminación de contaminantes. Mientras que estos métodos son minuciosos y modificables, inconvenientes incluyen coste, el consumo de tiempo y la necesidad de una ultracentrífuga para la separación de fracciones y más purificación a través de densidad gradiente centrifugación. Centrifugadoras de alta velocidad la mayoría están en un costo prohibitivo para investigadores individuales y son a menudo compartidas, base de equipos en instituciones académicas. Así, la disponibilidad de la ultracentrífuga se convierte en prohibitiva en estas situaciones.
En este protocolo de fraccionamiento se demuestra el aislamiento de fracciones subcelulares sin el uso de detergentes de solubilización y sin centrifugación de alta velocidad. Este método permitirá a los investigadores aislar la membrana plasmática, las mitocondrias y componentes citoplasmáticos de una célula eucariota con mínima contaminación entre fracciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
El desarrollo de este protocolo surge de la incapacidad de separar mitocondrial y las muestras de la membrana, usando kits disponibles en el mercado, para el análisis de la localización de la proteína durante la necroptosis14. Las limitaciones primarias de kits prefabricados son su incapacidad para adaptarse a las necesidades de los investigadores individuales, su costo por muestra y el número limitado de muestras capaces de ser procesados. El método presentado aquí se puede realizar sin el …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabajo fue financiado por los NIH-1R15HL135675-01 para Timothy J. LaRocca
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
Riferimenti
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