Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem o uso de centrifugação de alta velocidade. Esta técnica pode ser usada para purificar as fracções subcelulares para posterior exame de localização de proteínas através de immunoblotting.
Abstract
Neste protocolo, detalhamos um método para obter fracções subcelulares de células U937 sem o uso de ultracentrifugação ou detergentes indiscriminados. Este método utiliza buffers de hipotônicas, digitonin, Lise mecânica e centrifugação diferencial para isolar o citoplasma, mitocôndrias e membrana plasmática. O processo pode ser dimensionado para acomodar as necessidades dos investigadores, é barato e simples. Este método permitirá que os investigadores determinar a localização da proteína nas células sem centrifugadores especializados e sem o uso de kits comerciais, ambos dos quais podem ser proibitivamente caros. Com sucesso usamos este método para separar citosólica, membrana plasmática e proteínas mitocondriais em linhagem celular de monócitos humanos U937.
Introduction
Identificação fiável de localização da proteína é muitas vezes necessária, ao examinar as vias moleculares em células eucarióticas. Métodos para obter fracções subcelulares são utilizados pelos pesquisadores para examinar mais de perto os componentes celulares de interesse.
A maioria dos métodos existentes de fracionamento celular geralmente caem em duas categorias amplas, baseado em detergente1,2 e baseada em ultracentrifugação3,4,5, que pode ser diferenciadas por velocidade, precisão e custo. Protocolos baseados em detergente contam com o uso de buffers com crescente força detergente para solubilizar componentes distintos da célula. Este é um método rápido e conveniente para o processamento de amostras e pode ser rentável se o número e o tamanho das amostras são pequenas. Detergente com base em kits podem ser adquiridos para isolar citoplasmática membrana/organela (fração mista) e frações nucleares de células. No entanto, vários inconvenientes associados a estes kits limitam sua utilidade para pesquisadores. Eles são projetados para isolar facilmente um ou dois componentes da célula, mas são incapazes de isolar todas as frações de uma amostra simultaneamente. O uso de detergentes significa que a membrana plasmática e organelas de membrana-incluido vão ser igualmente solubilizadas e, portanto, incapaz de ser separados uns dos outros. Uma complicação adicional decorre os componentes proprietários nesses kits que impede que os investigadores alterando as condições para aplicações específicas. Por último, eles são limitados em número de usos e podem ser proibitivamente caros para experiências em maior escala. Kits de non-detergente com base existem para o isolamento de mitocôndrias, no entanto, eles não são projetados para isolar a membrana plasmática e o rendimento da amostra é significativamente menor do que a da centrifugação densidade com base em protocolos de isolamento6,7 .
Métodos que utilizam a ultracentrifugação para obter fracções são mais tempo consumindo, mas muitas vezes resultam em frações mais puras do que jogos baseados em detergente. Para isolar as membranas do plasma de células sem primeiro solubilizing-los (resultando em contaminação com organelas de membrana) os obriga a ser lysed por um método não-detergente seguido de separação de componentes celulares através do diferencial centrifugação — com isolamento de membrana plasmática que exigem velocidades de 100.000 × g para realizar. Em muitos casos, centrifugação diferencial deve ser seguida por isopícnica centrifugação de densidade gradiente para ainda mais a separação das frações celulares ou remoção de contaminantes. Enquanto esses métodos são minuciosos e modificável, desvantagens incluem a necessidade de um se para separação das frações e ainda mais purificação através de densidade gradiente centrifugação, consumo de tempo e custo. A maioria das centrífugas de alta velocidade são a um custo que é proibitivo dos investigadores individuais e são frequentemente partilhados, núcleo equipamentos em instituições acadêmicas. Assim, a disponibilidade se torna-se proibitivo nessas situações.
Neste protocolo de fracionamento, demonstramos o isolamento de frações subcelulares, sem o uso de detergentes de solubilizing e sem centrifugação de alta velocidade. Este método permitirá que pesquisadores isolar a membrana plasmática, mitocôndrias e componentes citoplasmáticos de uma célula eucariótica com contaminação mínima entre frações.
Protocol
Representative Results
Discussion
O desenvolvimento do presente protocolo surgiu de uma incapacidade de se separar mitocondrial e amostras de membrana, usando kits comercialmente disponíveis, para análise da localização da proteína durante necroptosis14. As limitações primárias de kits do premade são sua incapacidade de ser adaptado às necessidades dos investigadores individuais, o custo por amostra e número limitado de amostras capazes de serem processados. O método apresentado aqui pode ser realizado sem a utilizaç?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi acompanhado pelo NIH-1R15HL135675-01 para Timothy J. LaRocca
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
Riferimenti
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