Een verbeterde en hoge doorvoer respiratoir syncytieel Virus (RSV) Micro-neutralisatie Assay
Summary
Deze studie beschrijft een hoog debiet, imaging gebaseerde micro-neutralisatie test om te bepalen van de titer van neutraliserende antilichamen specifiek voor respiratoir syncytieel virus (RSV). Deze bepaling-indeling is getest op verschillende monster typen.
Abstract
Respiratoir syncytieel virus-specifieke neutraliserende antilichamen (RSV NAbs) zijn een belangrijke markering van bescherming tegen RSV. Een aantal verschillende assay formaten zijn momenteel in gebruik wereldwijd dus er is een behoefte aan een nauwkeurige en high-throughput methode voor het meten van RSV NAbs. Hier beschrijven we een imaging gebaseerde micro-neutralisatie bepaling die is getest op RSV deelgroep A en kan ook worden aangepast voor RSV deelgroep B en verschillende monster typen. Deze methode is zeer reproduceerbaar is, met inter assay variaties voor de referentie-antiserum wordt minder dan 10%. Wij geloven dat deze bepaling kan worden gemakkelijk vast te stellen in veel laboratoria wereldwijd tegen relatief lage kosten. Ontwikkeling van een verbeterde, hoge-doorvoer bepaling dat maatregelen van RSV NAbs vormt een belangrijke stap voorwaarts voor de normalisatie van deze methode internationaal evenals kritisch voor de beoordeling van nieuwe RSV vaccin kandidaten in de toekomst.
Introduction
Respiratoir syncytieel virus (RSV) is de belangrijkste oorzaak van infecties van de lagere luchtwegen in de pediatrische bevolking wereldwijd1. Ondanks haar hoge last is er nog geen vaccin of behandeling beschikbaar. Sinds 2013, heeft de World Health Organization (WHO) verklaard RSV vaccinontwikkeling prioritair grote onderzoeksprogramma, met jaarlijkse WHO overleg vergaderingen2,3. De WHO is overeengekomen over het gebruik van RSV neutraliserende antilichamen (NAb) meting volgen vaccin immunogeniciteit, zoals dit is erkend als belangrijke serologische markering van bescherming4. SurePress Touchscreen nAbs is aangetoond dat ze beschermen tegen ernstige RSV-infectie in een aantal studies alsook de klinische proeven van de anti-RSV monoklonaal antilichaam palivizumab, momenteel de alleen preventieve strategie beschikbaar4.
Er zijn meerdere NAb assay formaten gebruikt door laboratoria wereldwijd, met inbegrip van cel- en moleculaire gebaseerde testen, die hebben ingespannen normalisatie uitdagende5,6,7,8. De conventionele plaque-reductie neutralisatie (PRN) bepaling die meet het aantal verminderde plaque vorming van eenheden (PFU) door de aanwezigheid van een RSV-specifieke antilichaam blijft echter nog steeds de gouden standaard9. Wij rapporteren hier, een betere, vereenvoudigde en high-throughput PRN-protocol dat worden op talrijke cellijnen, voor verschillende RSV stammen en met verhoogde assay debiet gebruikt kan. Dit protocol is getest met behulp van klinische monsters uit verschillende instellingen alsmede op monsters uit dierlijk model experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij hebben ontwikkeld en geoptimaliseerd voor een eenvoudige en efficiënte RSV micro-neutralisatie assay die gemakkelijk kan worden aangepast in de meeste laboratoria. Deze test kan meten van vermogen van virale infectie, evenals het meten van de remming van de virale infectie door NAb op cellulair niveau met behulp van geautomatiseerde afbeelding scannen. Het gebruik van een imaging-gebaseerd platform en specifieke antilichaam gebaseerde systemen is toegenomen de specificiteit en de gevoeligheid voor spot detection in …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken alle betrokken deelnemers. Wij erkennen de Victoriaanse regering operationele infrastructuur Support Program. PVL is een NHMRC carrière ontwikkeling Fellowship-ontvanger.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Riferimenti
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
