En förbättrad och hög genomströmning Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay
Summary
Denna studie beskriver en hög genomströmning, imaging-baserade micro-neutralization assay att bestämma titern av neutraliserande antikroppar specifika för respiratory syncytial virus (RSV). Denna assay format har testats på olika provtyper.
Abstract
Respiratory syncytial virus-specifika neutraliserande antikroppar (RSV NAbs) är en viktig markör för skydd mot RSV. Ett antal olika assay format är för närvarande används över hela världen så det finns ett behov av en noggrann och hög genomströmning metod för att mäta RSV NAbs. Här beskriver vi ett imaging-baserade micro-neutralisering test som har testats på RSV undergruppen A och kan även anpassas för RSV undergruppen B och olika provtyper. Denna metod är mycket reproducerbara, med mellan analyser variationer för referens antiserumet är mindre än 10%. Vi anser att denna analys lätt kan fastställas i många laboratorier över hela världen till relativt låg kostnad. Utveckling av ett förbättrat, högt dataflöde test som mäter RSV NAbs utgör ett betydande steg framåt för standardiseringen av denna metod internationellt som är kritiska för utvärdering av romanen RSV vaccinkandidater i framtiden.
Introduction
Respiratory syncytial virus (RSV) är den ledande orsaken av nedre luftvägsinfektioner i den pediatriska population i världen1. Trots dess höga börda finns det fortfarande inget vaccin eller behandling. Sedan 2013 har den Världshälsoorganisationen (WHO) förklarat RSV vaccinutveckling prioriteras större forskning, med årliga WHO samråd möten2,3. WHO har kommit överens om med RSV neutraliserande antikroppar (NAb) mätning för att övervaka vaccin immunogenicitet, som detta är erkänd som den stora serologisk markören för skydd4. NAbs har visat sig skydda mot allvarliga RSV-infektion i ett antal studier samt kliniska prövningar av den anti-RSV monoklonal antikropp palivizumab, för närvarande endast profylaktisk strategi tillgängliga4.
I området i närheten finns det flera NAb assay format används av laboratorier över hela världen, inklusive cell- och molekylär-baserade analyser, som har gjort standardisering ansträngningar utmanande5,6,7,8. Dock fortfarande konventionella plack-minskning neutralisering (PRN) analysen som mäter antalet reducerade plackbildande enheter (PFU) av närvaron av en RSV-specifika antikroppar den gyllene standard9. Vi rapporterar här, en förbättrad, förenklade och hög genomströmning PRN-protokoll som kan användas på många cellinjer, för olika RSV stammar och med ökad assay genomströmning. Detta protokoll har testats med hjälp av kliniska prover från olika miljöer och på prover från djurmodell experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har utvecklat och optimerat en enkel och effektiv RSV mikro-neutralization assay som lätt kan anpassas i de flesta laboratorier. Denna analys är kunna mäta virusinfektion förmåga samt mäta hämning av virusinfektion av NAb på cellnivå med datoriserad bild scanning. Användning av en imaging-baserad plattform och specifika antikroppsbaserade system har ökat den specificitet och känslighet för spot detection jämfört med traditionella plack upptäckt metoder6,<sup class="xr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka alla inblandade deltagare. Vi erkänner den viktorianska regeringens operativa infrastrukturen Support Program. PVL är en NHMRC karriär utveckling-stipendiat.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Riferimenti
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
