Pretargeted Radioimmunotherapy op basis van de Inverse Electron vraag Diels-Alder reactie
Summary
Dit protocol beschrijft de synthese en de karakterisering van een trans– Cycloocteen (TCO)-gemodificeerde antilichaam en een 177Lu-geëtiketteerden tetrazine (Tz) radioligand voor pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). Daarnaast geeft het het gebruik van deze twee constructies voor in vivo ook en longitudinale therapie studies in een lymfkliertest model van colorectal kanker.
Abstract
Terwijl radioimmunotherapy (RIT) een veelbelovende aanpak voor de behandeling van kanker is, de lange farmacokinetische halveringstijd van radiolabeled antilichamen kan leiden tot hoge stralingsdoses voor gezonde weefsels. Misschien niet verrassend, hebben diverse verschillende strategieën ontwikkeld om deze verontrustende beperking omzeilen. Een van de meest veelbelovende van deze benaderingen is pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT vloeit voort ontkoppeling van de radionuclide van de immunoglobuline, injecteren van hen afzonderlijk, en dan het toestaan van hen om te combineren in vivo op het doelweefsel is terechtgekomen. Deze aanpak maakt gebruik van de uitzonderlijke eigenschappen van de tumor-targeting van antilichamen terwijl plinten hun farmacokinetische nadelen, waardoor stralingsdoses aan doelsoort weefsels te verlagen en vergemakkelijken van het gebruik van radionucliden met half-leven die beschouwd als te kort is voor gebruik in traditionele radioimmunoconjugaten. Ons laboratorium en anderen hebben de afgelopen vijf jaar, een benadering van in vivo pretargeting op basis van de reactie van de Diels-Alder (IEDDA) inverse elektron-vraag tussen trans– Cycloocteen (TCO) en tetrazine (Tz) ontwikkeld. Deze strategie is met succes toegepast op pretargeted positron emissie tomografie (PET) en single-photon emission tomography (SPECT) met een verscheidenheid van antilichaam-antigeen systemen imaging berekend. In een paar van de recente publicaties, hebben wij de doeltreffendheid van de IEDDA gebaseerde PRIT in lymfkliertest modellen van de alvleesklier ductaal adenocarcinoom en colorectaal carcinoom aangetoond. In dit protocol, beschrijven we protocollen voor PRIT met behulp van een 177Lu-DOTA-geëtiketteerden tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz) en een TCO gemodificeerde variant van het colorectaal carcinoom gericht op huA33 antilichaam (huA33-TCO). Meer in het bijzonder, beschrijven we de bouw van huA33-TCO, de synthese en de radiolabeling van [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz, en de prestaties van in vivo ook en longitudinale therapie studies in lymfkliertest modellen van colorectaal carcinoom.
Introduction
Radioimmunotherapy (RIT) — het gebruik van antilichamen voor de levering van therapeutische radionucliden aan tumoren — is al lang een verleidelijke benadering van de behandeling van kanker1,2. Inderdaad, deze belofte heeft al onderstreept door de Amerikaanse Food and Drug Administration de goedkeuring van twee radioimmunoconjugaten voor de behandeling van Non-Hodgkin lymfoom: 90Y-ibritumomab tiuxetan en 131-tositumomab3 , 4. maar zelfs vanaf zijn vroegste dagen, de klinische perspectieven op de RIT hebben belemmerd door een kritische complicatie: hoge straling dosistempo’s naar gezonde weefsels5,6. Algemeen radioimmunoconjugaten voor RIT worden aangeduid met langlevende radionucliden (bijvoorbeeld 131ik [t½ = 8.0 dagen] en 90Y [t½ = 2,7 dagen]) met fysieke helft-leven die met aansluiten de lang farmacokinetische halfwaardetijd van immunoglobulinen. Dit is essentieel, aangezien het zorgt ervoor dat voldoende radioactiviteit blijft zodra het antilichaam haar optimale ook na enkele dagen van verkeer bereikt. Echter, deze combinatie van lange verblijf tijden in het bloed en lang fysieke halfwaardetijd leidt onvermijdelijk tot dedoorstraling van gezonde weefsels, waardoor vermindering van therapeutische ratio’s en de beperking van de werkzaamheid van de therapie7. Verschillende strategieën werden onderzocht om te omzeilen van dit probleem, met inbegrip van het gebruik van afgekapte antilichaam fragmenten zoals Fab, Fab’, F(ab’)2, minibodies en nanobodies8,9,10. Een van de meest veelbelovende en fascinerend, maar onmiskenbaar complexe, alternatieve benaderingen is in vivo pretargeting11.
In vivo pretargeting is een benadering van nucleaire beeldvorming en therapie die tot doel heeft om uit te rusten van de exquise affiniteit en de selectiviteit van antilichamen terwijl hun farmacokinetische nadelen11,12,13plint. Te dien einde is het radiolabeled antilichaam gebruikt in traditionele radioimmunotherapy gedeconstrueerd in twee onderdelen: een klein molecuul radioligand en een immunoconjugate dat kan zowel een tumor-antigeen en de bovengenoemde radioligand binden. De immunoconjugate is eerste geïnjecteerd en gegeven een ‘voorsprong’, vaak enkele dagen, gedurende welke het hoopt zich op in het doelweefsel is terechtgekomen en wist uit het bloed. Daarna de klein molecuul radioligand wordt beheerd en combineert met de immunoconjugate op de tumor of snel wordt gewist uit het lichaam. Kortom, in vivo pretargeting is afhankelijk van het uitvoeren van radiochemie binnen het lichaam zelf. Door het verminderen van de verspreiding van de radioactiviteit, hierdoor tegelijkertijd beperkt stralingsdoses aan gezonde weefsels en vergemakkelijkt het gebruik van radionucliden (bijvoorbeeld 68Ga, t½ = 68 min211; Als t½ = 7.2 h) met half-levens die zijn doorgaans beschouwd als onverenigbaar met antilichaam gebaseerde vectoren.
Vanaf de late jaren 1980, een handvol van de verschillende benaderingen van in vivo pretargeting zijn ontwikkeld, met inbegrip van strategieën op basis van bispecifieke antilichamen, de interactie tussen streptavidine en biotine, en de kruising van complementaire oligonucleotides14,15,16,17,18. Nog is elk tegengehouden zijhetelkinverschillende mate door complicaties, meest beroemde de potente immunogeniciteit van daar gemodificeerde antilichamen19,20. De laatste vijf jaren heeft hebben onze fractie en anderen ontwikkeld een benadering van in vivo pretargeting op basis van de afbinding snelle en bioorthogonal inverse elektron vraag Diels-Alder tussen trans– Cycloocteen (TCO) en tetrazine (Tz) 21,22,23,24. De meest succesvolle van deze strategieën hebben ingezet een antilichaam TCO-bewerkt en een Tz-bevattende radioligand, zoals TCO meestal stabieler in vivo dan zijn Tz partner (Figuur 1)25,26 is. Net als in andere pretargeting methoden, is de mAb-TCO-immunoconjugate eerst beheerd en tijd krijgen om te wissen uit de roulatie en zich ophopen in de tumor weefsel. Daarna wordt de klein molecuul Tz radioligand geïnjecteerd, waarna het klikken met de immunoconjugate binnen het doelweefsel of wist snel uit het lichaam. Deze in vivo pretargeting strategie is zeer effectief gebleken voor PET en SPECT imaging met verschillende systemen van verschillende antilichaam/antigeen, consequent produceert beelden met een hoog contrast en waardoor het gebruik van korte duur radionucliden zoals 18 F (t½ = 109 min) en 64Cu (t-1/2 = 12,7 h)21,22,24. Meer recentelijk, de werkzaamheid van klik gebaseerde pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) is aangetoond in lymfkliertest modellen van de alvleesklier ductaal adenocarcinoom (PDAC) en colorectaal carcinoom27,28. Te dien einde, de therapeutische radionuclide 177Lu (βmax = 498 keV, t-1/2 = 6,7 dagen) was werkzaam in combinatie met twee verschillende antilichamen: 5B1, die gericht is op koolhydraten antigeen 19,9 (CA19.9) overal uitgedrukt in PDAC , en huA33, die gericht is op A33, een transmembraan glycoproteïne uitgedrukt in > 95% van colorectal kanker. In beide gevallen, deze benadering van 177Lu-PRIT leverde hoogactieve concentraties in tumor weefsel, gemaakt van een dosis-afhankelijke therapeutisch effect, en gelijktijdig verminderde activiteit concentraties in de gezonde weefsels in vergelijking met traditionele direct-label radioimmunoconjugaten.
In dit artikel beschrijven we protocollen voor PRIT met behulp van een 177Lu-DOTA-geëtiketteerden tetrazine radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz) en een TCO gemodificeerde variant van het antilichaam van de huA33 (huA33-TCO). Meer in het bijzonder, beschrijven we de bouw van huA33-TCO (Figuur 2), de synthese en de radiolabeling van [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz (Figuur 3 en Figuur 4), en de prestaties van in vivo ook en longitudinale therapie studies in lymfkliertest modellen van colorectaal carcinoom. Bovendien, de representatieve resultaten en discussie, we presenteren een verzameling voorbeeldgegevens, adres mogelijke strategieën voor de optimalisatie van deze aanpak, en overwegen van deze strategie in de bredere context van in vivo pretargeting en PRIT. Tenslotte is het belangrijk op te merken dat terwijl we hebben gekozen zich te richten op het pretargeting met behulp van huA33-TCO en [177Lu] Lu-DOTA-PEG7– Tz in dit protocol, deze strategie is zeer modulair en kan aangepast worden aan een breed scala aan antilichamen en radionucliden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een van de sterke punten van deze benadering van in vivo pretargeting — met name met betrekking tot strategieën gebaseerd op bispecifieke antilichamen en radiolabeled haptens — is zijn modulariteit: trans– Cycloocteen wordt kunnen worden toegevoegd aan een antilichaam, en tetrazine radioligands kan met een buitengewone verscheidenheid van radionucliden worden radiolabeled zonder afbreuk te doen aan hun vermogen om te reageren met hun partners klik. De aanpassing van deze aanpak naar andere antilich…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Jacob Houghton voor nuttig gesprekken. De auteurs ook bedank de NIH voor hun gulle financiering (R00CA178205 en U01CA221046).
Materials
| (E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) | Sigma-Aldrich | 764523 | Store at -80 °C |
| 2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS) | Sigma-Aldrich | 764701 | Store at -80 °C |
| Acetonitrile (MeCN) | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Ammonium Acetate (NH4OAc) | Fisher Scientific | A639-500 | |
| Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 70023 | Store at -20 °C |
| Dichloromethane (DCM) | Fisher Scientific | D143-1 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Fisher Scientific | D12345 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | Fisher Scientific | UFC205024 | |
| GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous | Fisher Scientific | AC610941000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 70-011-044 | 10x Concentrated |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -20 °C |
| Triethylamine (TEA) | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | A116-50 | |
| Tumor measuring device | Peira TM900 | Peira TM900 |
Riferimenti
- Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
- Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
- Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
- Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614 (2007).
- Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin’s Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
- Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin’s Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
- Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -. K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
- Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
- Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
- van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
- Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
- Goldenberg, D. M., Chatal, J. -. F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
- Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
- Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
- Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Ricerca sul cancro. 76 (22), 6669 (2016).
- Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
- Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406 (2000).
- Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
- Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227 (2004).
- Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
- Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
- Meyer, J. -. P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
- Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
- Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
- Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
- Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
- Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335 (2015).
- Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
- Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
- Meyer, J. -. P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
- Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
- Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95 (2017).
- Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).
