फेफड़ों के उन्नत इमेजिंग के एक प्रयोगात्मक में एक प्रायोगिक में मानव लिम्फोसाइटों पर आधारित एलर्जी सूजन के प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के आधार पर
Summary
यहां शुरू की प्रोटोकॉल के तहत vivo भड़काऊ परिस्थितियों में प्राथमिक मानव लिम्फोसाइटों के फेफड़ों के अभिलक्ष्यन क्षमता के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है । दत्तक ग्रहण की फुफ्फुसीय घुसपैठ एलर्जी की सूजन के एक माउस मॉडल में मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं को imaged और रासायनिक रूप से मंजूरी दे दी फेफड़ों के ऊतकों की प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मात्रा निर्धारित जा सकता है ।
Abstract
अत्यधिक सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भारी ऊतक संचय विभिन्न जीर्ण भड़काऊ रोगों की पहचान का प्रतिनिधित्व करता है और प्रभावित रोगियों के नैदानिक प्रबंधन में एक आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उभरा । आदेश में और अधिक अनुकूलन प्रो भड़काऊ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रोगविज्ञान असंतुलित ऊतक घुसपैठ के चिकित्सकीय नियमन पर लक्ष्य रणनीतियों, यह विशेष महत्व का होगा रोग में सुधार अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए-और अंग विशिष्ट परिधीय लिम्फोसाइटों के अभिलक्ष्यन गुण । यहां वर्णित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की अनुमति देता है प्रतिदीप्ति के फेफड़ों के संचय की निगरानी और adoptively पापेन प्रेरित फुफ्फुसीय सूजन के संदर्भ में मानव लिम्फोसाइटों हस्तांतरित । विट्रो assays में मानक के विपरीत अक्सर प्रतिरक्षा सेल माइग्रेशन और chemoटैक्सियों के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, अब vivo में शुरू की सेटिंग खाते में ले जाता है फेफड़े के विशिष्ट पहलुओं ऊतक संगठन और जटिल भड़काऊ के प्रभाव सजीव म्यूरिन जीव में होने वाला परिदृश्य । इसके अलावा, तीन आयामी क्रॉस-सेक्शनल प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति सूक्ष्म इमेजिंग न केवल घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है, लेकिन यह भी सूजन फेफड़ों के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका स्थानीयकरण के पैटर्न को दर्शाया गया है । कुल मिलाकर, हम पुराने भड़काऊ फेफड़ों के रोगों के क्षेत्र में प्रतिरक्षा अनुसंधान के लिए उच्च मूल्य की एक अभिनव तकनीक शुरू करने में सक्षम हैं, जो प्रदान की कदम द्वारा कदम-चरण प्रोटोकॉल का पालन करके आसानी से लागू किया जा सकता है.
Introduction
ऐसे एलर्जी अस्थमा और क्रोनिक प्रतिरोधी फेफड़े के रोग (copd) के रूप में फेफड़ों के क्लासिक भड़काऊ विकारों, अच्छी तरह से पल्मोनरी ऊतक1,2में सक्रिय लिम्फोसाइटों की एक वृद्धि की भर्ती के द्वारा संचालित हो जाना जाता है । लिम्फोसाइट जारी साइटोकिंस (जैसे, आईएल-4, आईएल-5, आईएल-9, आईएल-13, ifn-γ और tnf-α) आगे सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के chemoटैक्सियों को बढ़ावा देने, फाइब्रोटिक एयरवे remodeling प्रेरित या सीधे फेफड़ों पैरेन्काइमा2नुकसान. अब तक, अंतर्निहित फेफड़ों के ऊतकों के भीतर लिम्फोसाइटों की रोग संचय के लिए जिंमेदार तंत्र अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं । ऊतक-चयनात्मक टी सेल imprinting के लिए सादृश्य में आंत और त्वचा homing के लिए वर्णित है, पल्मोनरी डेन्ट्राटिक कोशिकाओं (DCs) स्पष्ट रूप से अधिमानी फेफड़ों की घुसपैठ के लिए प्रधानमंत्री परिधीय टी कोशिकाओं को सक्षम कर रहे हैं, पर CCR4 अभिव्यक्ति के प्रेरण के माध्यम से कम आंशिक रूप से लिम्फोसाइटों की सतह3. CCR4 के अलावा, एयरवे-टी कोशिकाओं घुसपैठ भी chemokine रिसेप्टर्स की एक विशेष रूप से वृद्धि की अभिव्यक्ति की विशेषता है CCR5 और CXCR3 परिधीय रक्त1,4,5के भीतर टी कोशिकाओं की तुलना में । कुल मिलाकर, मौजूदा डेटा अवधारणा के साथ संगत कर रहे है कि फेफड़ों के अभिलक्ष्यन टी लिम्फोसाइटों शारीरिक या भड़काऊ शर्तों के तहत विभिंन chemokine रिसेप्टर्स और उनके संबंधित लाइगैंडों की एक संख्या शामिल है और इस प्रकार महत्वपूर्ण एक बारीकी पर निर्भर करता है सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच नियंत्रित सहयोग1. विशेष रूप से, रोगज़नक़ या allergen जोखिम के प्रारंभिक चरण के दौरान, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं TLR उत्तेजना या IgE-mediated पार अलग chemoattractants की तत्काल रिहाई, LTB4, CCL1, CCL17 की तरह से जोड़ने के लिए जवाब, CCL22, CCL20, CXCL10 और pgd21,6,7. एक प्रमुख उदाहरण के रूप में, PGD2 और chemoattractant रिसेप्टर CRTh2 के बीच बातचीत Th2 कोशिकाओं के chemoattractant के लिए विशेष महत्व का होने के लिए जाना जाता है और इस तरह अस्थमा के नैदानिक प्रबंधन में वादा चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में दिखाई दिया । दरअसल, उदारवादी अस्थमा के रोगियों के लक्षण और एक दूसरे में मजबूर expiratory मात्रा की एक महत्वपूर्ण वृद्धि (fev1) एक चयनात्मक CRTh2 विरोधी के साथ उपचार के बाद placebo समूह8 की तुलना में एक सुधार दिखाया ,9. भड़काऊ प्रतिक्रिया की एक अधिक प्रगति की स्थिति में, पहले से ही भर्ती टी कोशिकाओं को और अधिक पल्मोनरी डीसी के लिए शक्तिशाली उत्तेजन के रूप में IL-4 और आईएल-13 की रिहाई के माध्यम से फेफड़े लिम्फोसाइट संचय बढ़ाना कर सकते हैं । बाद में, इन myeloid व्युत्पन्न जन्मजात कोशिकाओं अप-एक STAT6-निर्भर तरीके से1,10,11में CCL17 और CCL22 की अभिव्यक्ति को विनियमित. हालांकि वर्णित परिदृश्य की जटिलता अभी भी टी सेल फेफड़ों homing की एक पूरी समझ बाधा, यह भड़काऊ या एलर्जी फेफड़े के रोगों के एक संभावित अनुकूलित चिकित्सकीय नियंत्रण के लिए आणविक लक्ष्य के एक बहुतायत प्रदान करता है । इसलिए, अभिनव प्रायोगिक तकनीकों की तत्काल जरूरत है, जो टी सेल chemoटैक्सियों और फेफड़ों के homing के क्षेत्र में हमारे ज्ञान को और गहरा और पूरक करने में सक्षम हैं ।
तथ्य यह है कि फेफड़ों के मानव शरीर के भीतर लिम्फोसाइटों के अभिलक्ष्यन कई सेलुलर, humoral और भौतिक मानकों1से प्रभावित है के कारण, मौजूदा प्रयोगात्मक विधियों में से अधिकांश इस प्रतिरक्षा प्रक्रिया की पूरी जटिलता मॉडल करने में सक्षम नहीं हैं । इसके बजाय, फेफड़ों के विश्लेषण के लिए कई मानक प्रोटोकॉल एक विशिष्ट लिम्फोसाइट आकर्षण, आसंजन, प्रवास और अवधारण के झरना में शामिल पहलू पर ध्यान केंद्रित अभिलक्ष्यन । परिधीय या फेफड़ों पर integrins और chemokine रिसेप्टर्स की एमआरएनए या प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न के एक विशुद्ध रूप से वर्णनात्मक निर्धारण के अलावा लिम्फोसाइटों घुसपैठ और रक्त में संबंधित chemokine के स्तर के पूरक माप, ब्रोंकोएल्वेओलर लेवेज (बाल) या फुफ्फुसीय ऊतक12,13,14,15, विट्रो कोशिका संस्कृति में अच्छी तरह से स्थापित assays लिम्फोसाइट आसंजन या chemoटैक्सियों के एक कार्यात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति पर निर्धारित प्रयोगात्मक शर्तों16,17,18। सिद्धांत रूप में, विट्रो आसंजन assays में स्थैतिक एक endothelial मोनोलेयर करने के लिए या कांच की स्लाइड को पुनः संयोजक endothelial आसंजन अणुओं (जैसे, madcam-1, vcam-1), जबकि विट्रो में मानक के साथ लेपित करने के लिए सुसंस्कृत लिम्फोसाइटों की बाध्यकारी क्षमता की निगरानी chemoटैक्सियों assays आमतौर पर आदेश में लागू कर रहे है लिम्फोसाइटों की क्षमता एक transwell प्रणाली19में एक chemotaxis ढाल के साथ विस्थापित करने की मात्रा । दोनों विट्रो सेटिंग्स में एक नियंत्रित समायोजन और प्रयोगात्मक स्थितियों के मॉडुलन सक्षम है, लेकिन दूसरी ओर महत्वपूर्ण vivo chemoटैक्सियों और लिम्फोसाइटों की आसंजन में गंभीर रूप से प्रभावित करने के लिए जाना जाता चर की कमी है । मुख्य रूप से, स्थैतिक सेल संस्कृति assays कतरनी बलों के प्रभाव की उपेक्षा स्थाई रक्त प्रवाह19 और संभावित आसपास प्रतिरक्षा वातावरण की भागीदारी उपेक्षा और गैर लिम्फोसाइट प्रतिरक्षा कोशिकाओं बातचीत के कारण, दोनों एक जीवित जीव में मौजूद हैं । आदेश में इन सीमाओं को दूर करने के लिए, परिणामों की व्याख्या में स्थिर में प्राप्त विट्रो chemoटैक्सियों या पालन assays गतिशील आसंजन प्रयोगों में प्रवाह की स्थिति में आगे सत्यापन की जरूरत है20,21 और में विवो मॉडल भड़काऊ अंग विकृति के19। वास्तव में, टी के विनियमन पर महत्वपूर्ण निष्कर्ष सेल फेफड़े के तहत अभिलक्ष्यन भड़काऊ या एलर्जी की स्थिति पशु अध्ययन से तैयार किया जा सकता है आनुवंशिक रूप से संशोधित अलग फेफड़े के रोगों के परिभाषित मॉडल में चूहों का विश्लेषण3, 22 , 23. एक विशेष सेलुलर के प्रभाव को परिभाषित करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और मोटे तौर पर इस्तेमाल किया उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ब्याज की एक विशिष्ट जीन के लिए एक कमी के साथ वाइल्डटाइप चूहों और चूहों के बीच लिम्फोसाइटों घुसपैठ फेफड़ों की मात्रात्मक तुलना टी सेल वितरण के रोग चालित पैटर्न पर रास्ते या रिसेप्टर्स । हालांकि, विट्रो सेल संस्कृति assays में चर्चा से पहले के विपरीत, शास्त्रीय पशु मॉडल पर आधारित एक अध्ययन के डिजाइन का विश्लेषण करने और प्राथमिक मानव टी सीधे रक्त या एक भड़काऊ फेफड़ों से पीड़ित रोगियों के बाल से व्युत्पंन कोशिकाओं की निगरानी करने की क्षमता का अभाव रोग. इस प्रकार, यह अभी भी कार्यात्मक रूप से सत्यापित करना है कि क्या एक नैदानिक निर्दिष्ट फेफड़ों की बीमारी के लिए तरजीही फेफड़ों अनुवर्तन के लिए मानव लिम्फोसाइटों छाप में सक्षम है और कैसे दूर क्लिनिकल मापदंडों इस परिदृश्य पर प्रभाव पड़ सकता है चुनौतीपूर्ण रहता है । हाल ही में, vivo दृष्टिकोण में एक बहुत ही सुरुचिपूर्ण भड़काऊ आंत्र रोगों के संदर्भ में पेश किया गया था (ibd), जो इन सीमाओं के सबसे दूर करने में सक्षम था और आंतों लिम्फोसाइट अभिलक्ष्यन पर उन्नत शोधों अध्ययन के लिए नए रास्ते खोल दिया24 . एक शक्तिशाली इमेजिंग उपकरण के रूप में क्रॉस-सेक्शनल लाइट शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बाद विलायक-आधारित ऊतक समाशोधन के लिए प्रोटोकॉल का लाभ उठाते हुए, यह संभव था कि घुसपैठ और adoptively हस्तांतरित मानव टी कोशिकाओं के वितरण की कल्पना कोलाइटिक इमयूनो चूहों की आंत में24. विशेष रूप से, इस प्रायोगिक सेटिंग दो मुख्य नवाचारों को लागू किया: (1) प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के तहत वीवो शर्तों में परिभाषित प्रयोगात्मक विश्लेषण किया जा सकता है; (2) रोगग्रस्त अंग का एक अपेक्षाकृत बड़ा क्षेत्र (लगभग १.५ सेमी x १.५ सेमी) उच्च संकल्प गुणवत्ता में imaged जा सकता है, 3 डी पुनर्निर्माण के बाद । इसके अलावा, कई हाल ही के अध्ययनों को सफलतापूर्वक उंनत फेफड़ों इमेजिंग25,26के लिए महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सॉल्वेंट आधारित ऊतक समाशोधन और प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के उपयोग की स्थापना की । आदेश में फेफड़े प्रतिरक्षा विज्ञान के क्षेत्र में इस तकनीकी प्रगति से लाभ के लिए, अब हम फेफड़ों के homing के विश्लेषण के लिए प्रणाली को अपनाया ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रदान करता है एक कदम दर कदम परिचय कैसे शुद्ध करने के लिए और प्रतिदीप् त लेबल प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं प्रेरित फेफड़े की सूजन के साथ चूहों में हस्तांतरण के लिए और, इसके अलावा, विस्तार से प्रकाश की अनुवर्ती प्रक्रिया में वर्णन करता है चादर प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी इमेजिंग, अंग तैयार करने और छवि प्रसंस्करण सहित । कुल मिलाकर, हम एक परिष्कृत शुरू करने से भड़काऊ या एलर्जी फेफड़ों के रोगों के क्षेत्र में भविष्य शोधों अध्ययन का समर्थन करने की उंमीद है, लेकिन फिर भी संभव है, मानव लिम्फोसाइट की निगरानी के लिए प्रायोगिक मॉडल vivo स्थितियों में पर अभिलक्ष्यन फेफड़ों ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रयोगात्मक सेटिंग के तहत vivo भड़काऊ परिस्थितियों में प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं की फेफड़ों के अभिलक्ष्यन क्षमता की निगरानी और इस तरह प्रासंगिक रूप से प्रतिष्ठित विट्र…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक आभार DFG सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र SFB ११८१ और TRR २४१ द्वारा वित्त पोषण स्वीकार करते हैं । ऑप्टिकल इमेजिंग सेंटर Erlangen (ओआईसीए) और विशेष रूप से Ralf पाल्मिस्नो, फिलिप Tripal और टीना Fraaß (DFG CRC ११८१ की परियोजना Z2) प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति सूक्ष्म इमेजिंग के लिए विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार कर रहे हैं ।
Materials
| Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
| AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
| Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
| Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
| Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
| CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
| Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
| Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
| Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
| FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
| Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
| Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
| ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
| Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
| LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
| Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
| 30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
| Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
| Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
| LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) | anprotec | AC-AF-0018 | |
| RPMI medium | (Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
| PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
| PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
| Serological pipette 10 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
| Syringe 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
| Syringe 5 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
| Syringe 20 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
| Tube 1.5 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
| Tube 2 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
| Tube 2 ml, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
| Tube 15 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
| Tube 50 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
| Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |
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