Här introducerades protokollet tillåter karakterisering av den målsökande lungkapacitet av primära humana lymfocyter under Invivo inflammatoriska tillstånd. Pulmonell infiltration av adoptively överförda mänskliga immunceller i en musmodell av allergisk inflammation kan avbildas och kvantifieras av ljus ark fluorescensmikroskopi av kemiskt clearade lungvävnad.
Överväldigande vävnadsansamling av starkt aktiverade immuncellerna representerar ett kännetecken för olika kroniska inflammatoriska sjukdomar och framträtt som ett attraktivt terapeutiska mål i kliniska hanteringen av drabbade patienter. För att ytterligare optimera strategier som syftar till terapeutiska reglering av patologiskt obalanserad vävnad infiltration av pro-inflammatoriska immunceller, blir det särskilt viktigt att uppnå förbättrade insikter till sjukdom – och organ-specifika perifera lymfocyter homing egenskaper. Här beskrivs experimentella protokollet tillåter för att övervaka lung ackumulering av fluorescently märkta och adoptively överförda humana lymfocyter i samband med papain Exponeringsinducerad inflammation. Till skillnad från in vitro-standardanalyser som ofta används för analys av immunceller migration och Kemotaxis, nu introducerade Invivo inställningen tar konto lung-specifika aspekter av vävnad organisation och påverkan av komplexet inflammatoriska scenario som äger rum i den levande murina organismen. Dessutom tredimensionella tvärsnittsdata ljus ark fluorescens mikroskopbilder ger inte bara kvantitativa uppgifter om infiltrera immunceller, men också skildrar mönstret av immunceller lokalisering inom inflammerad lungan. Sammantaget kan vi införa en innovativ teknik för högt värde för immunologisk forskning i fältet av kroniska inflammatoriska lungsjukdomar, som lätt kan tillämpas genom att följa protokollet angivna steg för steg.
Klassiska inflammatoriska sjukdomar i lungorna, såsom allergisk astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol), är väl känt att drivas av en ökad rekrytering av aktiverade lymfocyter in i pulmonell vävnad1,2. Lymfocyter-släppt cytokiner (t.ex., IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ och TNF-α) ytterligare främja chemotaxis av medfödd och adaptiv immunceller, inducerar fibrotiska luftvägarna remodeling eller direkt skada på lungan parenkymet2. Hittills har är de underliggande mekanismerna som ansvarar för patologisk ansamling av lymfocyter i lungvävnaden ännu inte helt förstått. I analogi till vävnad-selektiva T cell imprinting beskrivs för tarmen och huden homing, pulmonell dendritiska celler (DCs) är självklart kunna prime perifera T-celler för förmånliga lunginfiltration, åtminstone delvis via induktion av CCR4 uttryck på den ytan av lymfocyter3. Förutom CCR4 kännetecknas luftvägarna-infiltrera T-celler också av ett särskilt ökat uttryck av chemokine receptorer CCR5 och CXCR3 jämfört med T-celler i perifert blod1,4,5. Övergripande, befintliga data är konsekventa med begreppet att lungan homing av T-lymfocyter fysiologiska eller inflammatoriska villkor omfattar ett antal olika chemokine receptorer och deras respektive ligander och därmed beror ytterst på en nära kontrollerade samarbete mellan medfödd och adaptiv immunceller1. Särskilt under den inledande fasen av patogen eller allergen exponering svarar celler av det medfödda immunsystemet TLR stimulering eller IgE-medierad cross-linking av omedelbar frigivning av olika chemoattractants, som LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 och PGD21,6,7. Som ett paradexempel, samspelet mellan PGD2 och korrektiv receptorn CRTh2 är kända för att vara av särskild betydelse för chemotaxis av Th2-celler och således synts så lovande terapeutiskt mål i kliniska hanteringen av astma. Faktiskt, patienter med måttlig astma visade en förbättring av symtom och en betydande ökning av forcerad exspiratorisk volym under en sekund (FEV1) efter behandling med selektiva CRTh2 antagonist jämfört med placebo gruppen8 ,9. I en mer avancerad tillstånd av den inflammatoriska reaktionen är redan rekryterade T celler att ytterligare förstärka pulmonell lymfocyter ackumulering via frisättningen av IL-4 och IL-13 som potenta stimuli för pulmonell DCs. Därefter uppreglera dessa myeloisk-derived medfödda celler uttryck för CCL17 och CCL22 i en STAT6-beroende sätt1,10,11. Trots komplexiteten i det beskrivna scenariot försvårar fortfarande en fullständig förståelse av T-cell lung homing, erbjuder det en uppsjö av molekylära mål för en potentiellt optimerad terapeutisk kontroll av inflammatoriska eller allergiska sjukdomar. Därför finns det ett akut behov av innovativa experimentella metoder, som har möjlighet att ytterligare fördjupa och komplettera vår kunskap inom T cell Kemotaxis och lung homing.
På grund av att lungorna homing av lymfocyter i kroppen påverkas av flera cellulära och humorala fysiska parametrar1, är de flesta av de befintliga experimentella metoderna inte kunna modellera hela komplexiteten i denna immunologiska process. Istället, fokusera många standardprotokoll för analys av lung homing selektivt på en särskild aspekt som är inblandade i kaskaden av lymfocyter attraktion, vidhäftning, migrering och lagring. Förutom en rent beskrivande bestämning av mRNA eller protein uttrycksmönstret av integriner och chemokine receptorer på perifera eller lung-infiltrera lymfocyter och kompletterande mätning av respektive chemokine nivåer i blod, bronkoalveolär lavage (BAL) eller pulmonell vävnad12,13,14,15, väletablerade in vitro rapportör cell kultur analyser tillåta en funktionell karakterisering av lymfocyter vidhäftning eller chemotaxisna vid definierade försöksbetingelser16,17,18. I princip övervaka statiska in vitro-vidhäftning analyser bindande kapacitet av odlade lymfocyter till en endothelial enskiktslager eller objektglas bestruket med rekombinant endothelial adhesionsmolekyler (t.ex. MAdCAM-1, VCAM-1), medan standard in vitro- chemotaxis analyser används vanligtvis för att kvantifiera lymfocyter förmåga att migrera längs en chemokine övertoning i en transwell system19. Båda in vitro-inställningarna aktivera en kontrollerad justering och modulering av experimentella förhållanden, men å andra sidan saknar viktiga variabler känd som kritiskt inverkan på Invivo Kemotaxis och vidhäftning av lymfocyter. Huvudsakligen, statisk cell kultur analyser bortse från påverkan av skjuvning krafter orsakade av den permanenta blod flöde19 och försumma potentiellt den omgivande immunologiska miljö och samverkande icke-lymfocyter immunceller, engagemang båda finns i en levande organism. För att övervinna dessa begränsningar, tolkning av resultat som förvärvats i statiska in vitro-chemotaxisna eller följsamhet analyser behöver ytterligare validering i dynamiska vidhäftning experiment under flöde villkor20,21 och i i vivo modeller av inflammatoriska orgel patologi19. Ja, viktiga slutsatser om regleringen av T-cell lung homing inflammatorisk eller allergisk villkor kunde dras från djurstudier analysera genetiskt modified möss i definierade modeller av olika lungsjukdomar3, 22 , 23. kvantitativ jämförelse av lung infiltrera lymfocyter mellan vildtyp möss och möss med en brist för en specifik gen av intresse utgör ett väletablerat och i stort sett används verktyg för att definiera effekterna av särskilda cellulär vägar eller receptorer på sjukdomen-driven mönster av T-cell distribution. I kontrast till innan diskuteras in vitro rapportör cell kultur analyser, saknar en studiedesign baserad på klassisk djurmodeller dock förmågan att analysera och övervaka primära humant T-celler som direkt härrör från blod eller BAL av patienter som lider en inflammatorisk lungsjukdom sjukdom. Alltså, det är fortfarande utmanande att funktionellt verifiera om ett diagnostiskt angivna lungsjukdom är kunna avtryck mänskligt lymfocyter för förmånliga lung tropism och hur långt kliniska parametrar kan påverka på detta scenario. Nyligen infördes ett mycket elegant Invivo synsätt i samband med inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD), som kunde övervinna de flesta av dessa begränsningar och öppnat nya vägar för avancerade translationella studier på intestinal lymfocyter homing24 . Dra nytta av protokoll för lösningsmedelsbaserade vävnad clearing följt av tvärsnittsdata ljus ark fluorescensmikroskopi som ett kraftfullt imaging verktyg, var det möjligt att visualisera infiltration och distribution av adoptively överförda mänskliga T celler i tarmen colitic nedsatt immunförsvar möss24. I synnerhet denna experimentella inställning genomfört två viktigaste innovationer: (1) primär mänsklig immunceller kan analyseras på experimentellt fastställda Invivo villkor; (2) ett ganska stort område av sjuka organ (ca 1,5 x 1,5 cm) kan avbildas i högupplöst kvalitet, följt av 3D-rekonstruktion. Dessutom etablerat flera färska studier framgångsrikt användningen av lösningsmedel-baserade vävnad clearing och ljus ark fluorescensmikroskopi som viktiga verktyg för avancerad lungcancer imaging25,26. Utnyttja detta tekniska framsteg i pulmonell immunologi, antagit vi nu systemet för analys av lung homing.
Här presenteras protokollet ger en stegvis introduktion hur att rena och fluorescently etikett primära humant T-celler för överföring till möss med inducerad Exponeringsinducerad inflammation och, dessutom i detalj beskriver den efterföljande processen av ljus-ark fluorescens mikroskopbilder, inklusive orgel förberedelse och bildbehandling. Sammantaget hoppas vi kunna stödja framtida translationella studier av inflammatoriska eller allergiska lungsjukdomar genom att införa en sofistikerad, men ändå genomförbar, experimentell modell för övervakning av mänskligt lymfocyter lung homing på förhållandena in vivo.
Den här beskrivna experimentella inställningen ger möjlighet att övervaka den målsökande lungkapacitet av primära mänskliga immunceller under Invivo inflammatoriska tillstånd och därmed relevant komplement klassiskt utförs in vitro-vidhäftning och chemotaxisna analyser. För att ta in i konto specifikt anatomiska organ egenskaper i lungan, viktiga aspekter av immunceller homing (inklusive Kemotaxis och cell distribution inom målorganet) samt klinisk relevans och överförbarhet a…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner tacksamt finansiering av DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 och TRR 241. Den optisk Imaging Centre Erlangen (OICE) och i särskilt Ralf Palmisano, Philipp Tripal och Tina Fraaß (projektet Z2 av de DFG CRC 1181) är erkända för teknisk expertsupport för ljus ark fluorescens mikroskopbilder.
Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) | anprotec | AC-AF-0018 | |
RPMI medium | (Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
Serological pipette 10 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
Syringe 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
Syringe 5 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
Syringe 20 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
Tube 1.5 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
Tube 2 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
Tube 2 ml, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
Tube 15 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
Tube 50 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |