Analizzando il tasso di consumo di ossigeno nei Cardiomyocytes neonatali coltivati primari del topo utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è quello di illustrare come utilizzare cardiomiociti neonatali del mouse come sistema modello per esaminare come i vari fattori possono alterare il consumo di ossigeno nel cuore.
Abstract
Mitocondri e metabolismo ossidativo sono fondamentali per mantenere la funzione del muscolo cardiaco. La ricerca ha dimostrato che la disfunzione mitocondriale è un fattore importante che contribuisce alla funzione cardiaca alterata trovato nello scompenso cardiaco. Al contrario, ristabilimento della funzione mitocondriale difettosa può avere effetti benefici per migliorare la funzione cardiaca nel cuore di venire a mancare. Pertanto, lo studio dei meccanismi di regolamentazione e identificando nuovi regolatori per la funzione mitocondriale potrebbe fornire insight che potrebbero essere usate per sviluppare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento di malattie cardiache. Qui, la respirazione mitocondriale cardiaca del miocita è analizzata utilizzando un sistema di coltura cellulare unico. In primo luogo, un protocollo è stato ottimizzato per isolare rapidamente e cardiomiociti neonatali del mouse ad alta redditività della coltura. Quindi, un analizzatore di flusso extracellulare formato da 96 pozzetti viene utilizzato per valutare il tasso di consumo di ossigeno di questi cardiomiociti. Per questo protocollo, abbiamo ottimizzato le condizioni di semina ed abbiamo dimostrato che tasso di consumo ossigeno cardiomiociti neonatali del mouse può essere facilmente valutata in un analizzatore di flusso extracellulare. Infine, notiamo che il nostro protocollo può essere applicato a una dimensione maggiore di cultura e altri studi, come ad esempio la segnalazione intracellulare e contrattile funzionano analisi.
Introduction
Per sostenere una continua funzione contrattile cardiaca, cardiomiociti devono mantenere una fornitura costante di energia cellulare principalmente sotto forma di ATP1. Nel cuore, circa il 95% del trifosfato di adenosina è generato dai mitocondri, principalmente attraverso la fosforilazione ossidativa, mostrando che i mitocondri svolgono un ruolo cruciale di bioenergetico nella funzione cardiaca2,3. Sostenere questa nozione è che disregolazione della funzione mitocondriale può condurre a cardiomiopatia e insufficienza cardiaca4,5. Al contrario, ripristinare la funzione mitocondriale è stato indicato per migliorare la funzione cardiaca di failover cuore6,7. Pertanto, studiando il meccanismo della bioenergetica mitocondriale e identificando nuovi regolatori della funzione mitocondriale in cardiomiociti non rivelerà solo intuizioni meccanicistiche della produzione di energia cardiaca ma anche potrebbe fornire la comprensione che porterà allo sviluppo di nuovi bersagli terapeutici per il trattamento di malattie di cuore6,8.
Rispetto a tutto il cuore, che contiene una miscela di miociti e non miociti9, culture dei cardiomiociti sono estremamente puro, con contaminazione minima del non-miociti dal cuore, come fibroblasti e cellule endoteliali10. Inoltre, isolando cardiomiociti da cuccioli neonatali consente la coltura di un gran numero di cellule in una piccola quantità di tempo, rispetto alle celle d’isolamento dal cuore adulto10,11. La cosa più importante, cardiomiociti coltivati primari del topo adulto hanno breve sopravvivenza volte (es. 24 ore) e a più lungo tempo punti de-differenziano. Cardiomiociti neonatali del mouse possono sopravvivere ed essere manipolati per più di 7 giorni nella cultura, che li rende ideali per testare gli effetti della droga composti e manipolazione del gene sulla funzione dei mitocondri in cardiomiociti10. Naturalmente, ci sono significative differenze biologiche tra le cellule adulte e neonatali, ma la durata più lunga disponibile per la coltura di cellule neonatali li rende adatti a diversi tipi di studi, compresi quelli della funzione mitocondriale.
Ad oggi, cardiomyocytes neonatali coltivati primario di topo e di ratto sono stati utilizzati come modelli per lo studio cardiaco bioenergetica12,13. Negli ultimi anni, studi utilizzato un analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e valutare la capacità ossidativa nel topo e nel ratto cardiomiociti neonatali14,15. Mentre rispetto ai ratti, l’attuabilità delle cellule di cardiomiociti neonatali del mouse è più basso e ha una maggiore variabilità16. Inoltre, la possibilità di studiare le cellule da modelli murini geneticamente rende il modello di cella del mouse molto importante. Dato che gli studi OCR sono così sensibili alla cella numero e densità di semina, è necessario lo sviluppo di un protocollo riproducibile, affidabile e semplice per raggiungere la redditività e il rendimento delle celle coerente.
Qui, segnaliamo un protocollo ottimizzato che è stato sviluppato che utilizza cardiomyocytes neonatali coltivati del topo con un analizzatore di flusso extracellulare formato da 96 pozzetti per analisi OCR. Questo protocollo aumenta notevolmente la riproducibilità del test. Inoltre, il protocollo non solo fornisce un romanzo e un metodo riproducibile per analisi OCR, ma anche può essere adattato ad una cultura di dimensioni più grande per altri scopi sperimentali, come quello che potrebbe essere necessario per studiare funzioni miofibrillare e intracellulare vie di segnalazione.
In particolare, il presente protocollo descrive una procedura di un giorno di isolamento e coltura dei cardiomiociti neonatali del mouse in una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti. Inoltre, descrive la procedura per misurare il consumo di ossigeno utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Tutte le soluzioni utilizzate sono sterili o filtrato sterile. Tutti gli strumenti sono sterilizzati con etanolo al 75%. Forniamo una Tabella materiali per le varie parti della procedura. Per la coltura di cardiomiociti, tutte le procedure e i passaggi vengono eseguiti in una cappa di cultura cellulare standard. Questo protocollo è sviluppato per l’isolamento dei cuori neonatali del mouse da una cucciolata (circa 8-10 cuccioli). Tuttavia, il protocollo può anche essere adattato per isolare i cardiomiociti da cucciolate più.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo stabilito un protocollo semplice per isolamento e la coltura del mouse cardiomiociti neonatali. Utilizzando questi cardiomiociti, abbiamo ottimizzato anche le condizioni per misurare il tasso di consumo di ossigeno utilizzando un sistema di analisi di flusso extracellulare. Il protocollo permette di utilizzare cardiomiociti neonatali del mouse come sistema modello per esaminare come i vari fattori possono alterare il consumo di ossigeno nelle cellule del lavoro principale del cuore, simile a que…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare tutti i lab di Ross e membri del laboratorio di Murphy. Questo lavoro è supportato da American Heart Association (14SDG17790005) per Y.C. NIH (HL115933, HL127806) e VA al merito (BX003260) a R.S.R.
Materials
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
Riferimenti
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