En fluorescens-basert metode å studere bakteriell Gene regulering i infiserte vev

Summary

Beskrevet her er en metode for å analysere bakteriell genuttrykk dyr vev på cellenivå. Denne metoden gir en ressurs for å studere fenotypiske mangfoldet innenfor en bakteriell befolkning svar på vev miljøet under en infeksjon.

Abstract

Bakteriell virulens gener er ofte regulert på transcriptional nivå av flere faktorer som svarer til ulike Miljøsignaler. Noen faktorer handle direkte på virulens gener; andre kontrollere patogenesen ved å justere uttrykk for nedstrøms regulatorer eller akkumulering av signaler som påvirker regulator aktivitet. Mens regulering har vært studert under i vitro vekst, er relativt lite kjent om hvordan genuttrykk justeres under infeksjon. Slik informasjon er viktig når en bestemt gen er en kandidat for terapeutisk intervensjon. Transcriptional tilnærminger som kvantitative, real-time RT PCR og RNA-Seq er effektive måter å undersøke genuttrykk på globalt nivå men lider mange tekniske utfordringer, inkludert lav overflod av bakteriell forhold til verten RNA og utvalg degradering av RNases. Evaluere regulering med fluorescerende journalister er relativt lett og kan være multiplekset med fluorescerende proteiner med unike spectral egenskaper. Metoden gir encellede, spatiotemporal analyse av genuttrykk i vev som viser komplekse tredimensjonale arkitektur og physiochemical forløpninger som påvirker bakteriell regulatoriske nettverk. Slik informasjon er tapt når dataene er gjennomsnitt over bulk befolkningen. Her, beskriver vi en metode for å kvantifisere byggkorn under bakteriell patogener i situ. Metoden er basert på enkel vev behandling og direkte observasjon av fluorescens fra reporter proteiner. Vi viser nytten av dette systemet ved å undersøke uttrykket av Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), med gene produktet kreves for immun evasion og full virulens ex vivo og in vivo. Vi viser at nuc-gfp er sterkt uttrykt i nyre abscesser og avsløre heterogene genuttrykk grunn delvis til tilsynelatende romlige regulering av nuc promoter aktivitet i abscesser blir engasjert i immunforsvaret. Metoden kan brukes på alle bakterie med manipulatable genetisk system og noen infeksjon modell, gir verdifull informasjon for prekliniske studier og narkotika utvikling.

Introduction

Bakterier reagerer på endre fysiologiske forhold og endringer i miljøet ernæringsmessige staten ved narkotikalovgivningen uttrykke genene kreves for tilpasning og overlevelse. For eksempel koloniser opportunistiske patogener overflater ved relativt lav tetthet, og er ofte harmløse. Men når bakterien har trengt fysiske og kjemiske barrierer, må det kjempe med verten immun cellen mot forsvar og begrenset næringsstoffer tilgjengelighet¹. Som et eksempel, Staphylococcus aureus colonizes omtrent en tredjedel av befolkningen asymptomatically men er også årsaken til ødeleggende huden og bløtvevet infeksjoner, osteomyelitt, endokarditt og bacteremia². Suksess for S. aureus som en patogen er ofte knyttet til metabolske fleksibiliteten samt et arsenal av knyttet til overflaten, utskilles virulens faktorer som aktiverer bakterien rømme blodet og gjenskape i perifere vev ^3,4,5. Verten død på grunn av stafylokokk sykdom er en evolusjonær blindspor og grenser overføring til nye verter⁶, må forpliktelse til virulens faktor produksjon bli nøye kontrollert.

En kompleks regulatoriske nettverk av proteiner og ikke-koding RNAs svarer til et utvalg av miljømessige stimuli, inkludert celle tetthet, vekstfase, nøytrofile-assosiert faktorer og næringsstoffer tilgjengelighet, slik at virulens gener som er uttrykt i den nøyaktig tid og sted i vert vev^{7,8,9,10,11,12,13}. For eksempel regulerer tidlig/S to komponent systemet (TCS) uttrykk for virulens faktorer via sensor kinase (SaeS) og svar regulator (tidlig)¹⁴. SaeS er autophosphorylated på en bevart histidin rester svar til verten signaler (f.eks, menneskelige nøytrofile peptider [HNPs], calprotectin)^8,15,16. Gruppen phosphoryl deretter overført til en aspartate rester tidlig aktivere det som en DNA-bindende protein (tidlig ~ P)¹⁷. Tidlig/S TCS regulerer over 20 gener som bidrar til patogenesen inkludert fibronectin binding proteiner (FnBPs), leukocidins og coagulase^14,18,19,20. Mål kan klassifiseres i høy affinitet og lav-affinitet genet mål, som trolig indusert som tidlig ~ P stiger når de utsettes for sine signaler²¹. Tidlig/S aktiviteten er kontrollert av andre regulatorer av genuttrykk som tok quorum sensing systemet, repressor av giftstoffer protein (Rot) og alternativ sigma faktor B (SigB)^22,23,24.

NUC er en Sae-avhengige virulens genet i Staphylococcus aureus og koder thermonuclease (Nuc), som er avgjørende for rømmer fra neutrophilic extracellular trapper (nett) og formidling under den løpet av infeksjon^25,26. Uttrykk for nuc er også sterkt indirekte undertrykt av CodY i nærvær av forgrenede-kjeden aminosyrer og GTP²⁷, og direkte undertrykt av stafylokokk tilbehør regulator protein SarA^28,29 , der aktiviteten påvirkes av oksygen (redoks tilstand) og pH³⁰. Gitt at sae og nuc mutanter er svekket i musen modeller av infeksjon, er det interesse for å utvikle kjemiske intervensjoner som hemmer deres tilsvarende aktiviteter^26,31. Til tross for dette er det ingen informasjon om deres regulering under infeksjon.

Fluorescerende journalister har blitt brukt til å overvåke og kvantifisere genuttrykk på enkeltcelle nivå. Her presenterer vi en metode for å kvantifisere S. aureus genuttrykk under infeksjon, da sammen med i vitro transcriptome analyse og kraftig Bildeteknikker som magnetisk resonans imaging (MRI) og magnetisk resonans spektroskopi (MRS), kan avsløre hvordan bakteriell fysiologi er regulert i vivo og den relative abundances av næringsstoffer i enkelte nisjer. Metoden kan brukes på alle bakteriell patogen med en tett genetisk.

Oversikt over genomet integrerende vektoren.

Genomet integrerende vektor pRB4 inneholder 500 base parene hver fra oppstrøms og nedstrøms for S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene å lette homologe rekombinasjon. pRB4 er avledet fra temperatur-sensitive pMAD vektor ryggraden som inneholder erythromycin motstand kassett (ermC) og thermostable beta-galactosidase gene bgaB for blå/hvit screening av recombinants³². Foretatt reporter Konstruer inneholder også en chloramphenicol motstand markør (katten) for valg etter genomet integrering og plasmider eliminering, samt EcoRI og SmaI områder å fusjonere regulatoriske regionen rundt superfolder Green fluorescerende protein (sGFP) (figur 1). Det er kjent at valg av ribosom bindende nettsted (RBS) påvirker aktiviteten til reporteren, og ofte krever empirisk optimalisering³³. Dermed er en RBS ikke levert. Her, innfødt ribosom binding området brukes til å gi en mer naturlig mønsteret av genuttrykk, men andre steder kan brukes.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Georgetown University. 1. generasjon fluorescerende Reporter belastningen Fordøye genomet integrerende pRB4 vektoren sekvensielt med EcoRI og SmaI begrensning enzymer. Etter produsentens protokoll, sette opp en overnatting fordøyelsen med SmaI bruker 1 µg av pRB4 ved 25 ° C, og deretter fortsette med andre fordøyelsen 1t på 37 ° C ved å legge EcoRI til reaksjonsblanding…

Representative Results

Vi utviklet en plasmider avledet fra pMAD32 som kan levere en reporter fusion konstruksjon i kromosomet av double crossover homologe rekombinasjon (figur 1). Denne konstruksjonen gir kvantitativ analyse av noen regulerende område som støtter produksjon av GFP protein og fluorescerende signalet over bakgrunnen. Plasmider gir ampicillin motstand (Apr) for vedlikehold og forplantning i E. coli og gir erythromycin mot…

Discussion

Bakteriell infeksjonssykdommer er et økende helseproblem over hele verden på grunn av oppkjøpet av antibiotikaresistens determinanter⁴⁶. Tilpasning til vertsmiljøer er avgjørende for vekst og overlevelse under infeksjon, kan strategier målretting gene expression programmer som øker patogen fitness være nyttig therapeutically. Et slikt program er et sett av gener som er kontrollert av tidlig/S to komponent system (TCS), vist tidligere å spille en viktig rolle i immunforsvaret evasion<sup c…

Materials

5% sheep blood	Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)	A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	ThermoScientific	R0402
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
C57Bl/6 Mice	Charles River	NA
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378
confocal laser scanning microscope	Zeiss	NA
cryostat microtome	Thermo Scientific	NA
Culture, Cap	VWR International	2005-02512
D+2:25NA Oligo	Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)	NA
DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E5389
Flow Analyzer	Becton Dickinson	NA
glass beads	Sigma	Z273627
Miniprep, plasmid	Promega	A1220
orbital shaking water bath	New Brunswick Innova	NA
PCR purification	QIagen	28106
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Plate reader	Tecan	NA
Precellys 24 homogenizer	Bertin Laboratories	NA
pUC57-Kan	GenScript (Piscataway, NJ)	NA
Q5 Taq DNA Polymerase	New England Biolabs (Ipswich, MA)	M0491S
Restriction Enzymes	New England Biolabs (Ipswich, MA)	R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase	New England BioLabs	E6300L
Sanger Sequencing	Genewiz (Germantown, MD)	NA
Sub Xero clear tissue freezing medium	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
superloop	GE Lifesciences	18111382
Syringe, Filter	VWR International	28145-481
Syto 40	Thermo Fisher Scientific	S11351	Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660
Tryptic Soy Broth	VWR	90000-376
UV-visible spectrophotometer	Beckman Coulter-DU350	NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500