Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Ranjan K. Behera; Kevin D. Mlynek; Matthew S. Linz; Shaun R. Brinsmade

doi:10.3791/59055

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Articolo metodologico

Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

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DOI:

10.3791/59055

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19 febbraio 2019

Ranjan K. Behera¹ , Kevin D. Mlynek¹ , Matthew S. Linz¹ , Shaun R. Brinsmade¹

¹Department of Biology, Georgetown University

In questo articolo

Sommario

Qui descritto è un metodo per l'analisi di espressione genica batterica nei tessuti animali ad un livello cellulare. Questo metodo fornisce una risorsa per studiare la diversità fenotipica che si verificano all'interno di una popolazione batterica in risposta all'ambiente del tessuto durante l'infezione.

Abstract

Geni di virulenza batterica sono spesso regolati a livello trascrizionale da diversi fattori, che rispondono a differenti segnali ambientali. Alcuni fattori agiscono direttamente sui geni di virulenza; altri controllano patogenesi regolando l'espressione di regolatori a valle o l'accumulo di segnali che influiscono sull'attività del regolatore. Mentre il regolamento è stato studiato estesamente durante la crescita in vitro , relativamente piccolo è conosciuto circa come espressione genica è regolata durante l'infezione. Tali informazioni sono importanti quando il prodotto di un particolare gene è un candidato per l'intervento terapeutico. Trascrizionali approcci come RT-PCR quantitativa, in tempo reale e RNA-Seq sono potenti modi per esaminare l'espressione genica a livello globale, ma soffrono di molte sfide tecniche, tra cui scarsa abbondanza di RNA batterico rispetto al host RNA e campione degradazione di RNAsi. Valutazione regolamento utilizzando reporter fluorescenti è relativamente facile ed è canalizzabile con proteine fluorescenti con proprietà spettrali uniche. Il metodo consente analisi unicellulare, spazio-temporale dell'espressione genica in tessuti che presentano complessi gradienti di architettura e chimico-fisico tridimensionale che influiscono sulle reti di regolazione batteriche. Tali informazioni vengono perse quando i dati sono una media sopra la popolazione di massa. Qui, descriviamo un metodo per quantificare l'espressione genica in batteri patogeni in situ. Il metodo si basa sull'elaborazione di tessuto semplice e diretta osservazione della fluorescenza da proteine reporter. Dimostriamo l'utilità di questo sistema esaminando l'espressione di Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), prodotto del gene di cui è necessario per evasione immune e virulenza completo ex vivo e in vivo. Vi mostriamo quello nuc-gfp è fortemente espresso in Ascessi renali e rivelare espressione genica eterogenei dovuti in parte al regolamento apparente spaziale dell'attività del promotore nuc in ascessi pienamente impegnata con la risposta immunitaria. Il metodo può essere applicato a qualsiasi batterio con un sistema genetico manipolabile e qualsiasi modello di infezione, fornendo informazioni preziose per gli studi preclinici e lo sviluppo di farmaci.

Introduzione

Batteri di rispondere alle mutevoli condizioni fisiologiche e alterazioni dello stato nutrizionale del loro ambiente esprimendo differenzialmente geni richiesti per la sopravvivenza e di adattamento. Per esempio, agenti patogeni opportunistici colonizzano corpo superfici a relativamente basso densità e spesso sono innocui. Tuttavia, una volta che il batterio ha penetrato le barriere fisiche e chimiche, esso deve vedersela con contro-difese ospite delle cellule immuni e limitata disponibilità nutriente¹. Ad esempio, lo Staphylococcus aureus colonizza circa un terzo della popolazione senza sintomi ma è anche la causa della devastante del....