מדידה רגישה מאוד של חדירות הפקאוליות בעכברים עם פלואורואסעין איזוטיקריאט-פוליסוכרוז 70
Summary
בעכברים המשתמשים במעקב. רגיש ולא רדיואקטיבי שיטה זו מאפשרת ניתוחי שתן חוזרים ונשנים עם כמויות שתן קטנות.
Abstract
אובדן אלבומין בשתן (אלבומין) צופה תוצאות לב וכלי דם. בתנאים פיזיולוגיים, כמויות קטנות של אלבומין מסוננים על ידי הפקעית ונספג מחדש במערכת הכרישים עד למגבלת הספיגה. לפיכך, מגדילה מוקדמת של סינון האלבומין הפתולוגי עלול להיות חסר על ידי ניתוח אלבומין. לכן, השימוש במשדרים כדי לבדוק את הפרסלקטיביות מופיע כיתרון. מעקב אחר התווית fluorescocyanate (FITC)-פוליסוקרוז (כלומר, FITC-Ficoll) ניתן להשתמש כדי ללמוד את המנתקטיביות. מולקולות FITC-polyסוכות מסוננים בחופשיות על ידי הפקעית, אך לא נספג מחדש במערכת הכרישים. בעכברים וחולדות, FITC-polysucrose נחקר במודלים של חדירות הפקפיות באמצעות הליכים מורכבים מבחינה טכנית (כלומר, מדידות רדיואקטיביות, כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים [הכדאיות], סינון ג’ל). יש לנו שינוי והקלה בפרוטוקול FITC-polysucrose מבוססי מעקב כדי לבדוק עליות מוקדם וקטן בחדירות הפקליות כדי FITC-polysucrose 70 (גודל אלבומין) בעכברים. שיטה זו מאפשרת ניתוחי שתן חוזרים עם אמצעי השתן הקטנים (5 μL). פרוטוקול זה מכיל מידע על כיצד מעקב FITC-polysucrose 70 מוחל באופן הפנים והשתן נאסף באמצעות קטטר השתן פשוטה. שתן מנותח באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטית מנורמל לסמן ריכוז שתן (קריאטינין), ובכך להימנע הליכים מורכבים מבחינה טכנית.
Introduction
פגמים פונקציונליים או מבניים בתוך המכשול סינון פקייתי להגדיל את חדירות הפקתית לאלבומין, וכתוצאה מכך הזיהוי של אלבומין בשתן (אלבומין). אלבומין מנבא תוצאות לב וכלי דם והוא סמן חשוב לפציעה בלתי מסומנת1. אפילו רמות נמוכות של אלבומין, שוכב בטווח הנורמלי, משויכים לסיכון לב וכלי דם מוגבר1.
בתנאים פיסיולוגיים, אלבומין מסונן דרך הגלובולוס וכמעט לחלוטין נספג מחדש במערכת הכרישים2,3. בעכברים, הגילוי של אלבומין בשתן מבוצע בדרך כלל על ידי שיטת חיסוני מקושרת של האנזים (אליסה) מתוך 24 שעות של איסוף שתן. אם שתן של 24 שעות בתוך אוסף שתן או שתן ספוט משמש, הבדלים קטנים ריכוזי אלבומין עלול להחמיץ עקב בעיות רגישות. רוב החוקרים, לכן, להשתמש במודלים בעלי חיים שבו אלבומין הנגרמת על ידי פגיעת כליות חזקה עקב רעלים, סמים, ניתוח כליות.
לפיכך, מציאת שיטה רגישה לגילוי שינויים קטנים וארעיים בחדירות הפקפיות, חשובה מאוד לתחום. Rippe ואח ‘ הציגו מודל חולדה כדי לבחון חדירות פקפיות על ידי החלת מעקב התווית fluorescently כלומר FITC-polysucrose 70 (כלומר, FITC-Ficoll 70), בגודל של אלבומין4. יישום המעקב מאפשר בדיקה של שינויים לטווח קצר בחדירות הפקליות (בתוך דקות) והוא רגיש מאוד4. שני מחקרים השתמשו בשיטת המעקב. בעכברים5,6 למרות היתרונות שלה, שיטה זו, למרבה הצער, יש חסרונות: זה מבחינה טכנית מאוד מורכב, רדיואקטיבי, פולשנית. ניתוח נוסף של השתן מתבצע רק על ידי שימוש בסינון ג’ל או הוצאת מידות5,6.
בתוך הנייר הזה, אנו מציגים חלופה חלופית, רגיש, לא רדיואקטיבי, ומהירה שיטה למדוד חדירות הפקפיות בעכברים באמצעות פלואורוסקופים התווית FITC-polysucrose 70. על ידי החדרת קטטר ההמרה, השתן אוסף הוא פחות פולשנית מאשר ניקוב שלפוחית השתן, דלקת כריתת גרון, ויישום קטטר suprapubic, ומאפשר איסוף שתן לפחות כל 30 דקות. ניתוח שתן מבוצע מכמויות קטנות (5μL) באמצעות קורא לוחית פלורסנט. ריכוזי המעקב בשתן מנורמלות לריכוזי קריאטינין בשתן באמצעות שיטת קריאטינין אנזימטית.
לכן, שיטה זו הרומן מציע כלי רגיש כדי ללמוד פציעה מוקדמת פקפיות עם חדירות מוגברת.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצגת מאפשרת לחוקר לבדוק חדירות הפקפיות בעכברים באופן רגיש מאוד באמצעות מכשיר מעקב. עם שיטה זו, עליות לטווח קצר בחדירות הפקפיות ניתן לאבחן באמצעות כמויות קטנות בלבד של שתן. הצעדים הקריטיים ביותר עבור מאסטרינג בהצלחה טכניקה זו הם 1) לפתח מומחיות ידנית בניתוח העכבר, במיוחד בצינורית ש?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לכריסטינה שוואנדט, בלנקה Duvnjak, ו ניקולא Kuhr עבור הסיוע הטכני היוצא דופן שלהם ד ר. דניס סון על עזרתו עם הסריקה הפלואורסצנטית. מחקר זה היה נתמך על ידי מענק של הגרמני Forschsgeמייסמייססביס2 (DFG) SFB 612 TP B18 כדי L.C.R. ו L.S. לפאנדר לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
Riferimenti
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
