Her presenterer vi en protokoll for å teste glomerulær permeabilitet i mus ved hjelp av en svært følsom, radioaktivt Tracer. Denne metoden tillater repeterende urin analyser med små urin volumer.
Tapet av albumin i urinen (albuminuri) spår kardiovaskulære utfall. Under fysiologiske forhold filtreres små mengder albumin av glomerulus og reabsorberes i rørsystemet frem til absorpsjons grensen nås. Tidlig økning i patologisk albumin filtrering kan dermed bli savnet ved å analysere albuminuri. Derfor, bruk av Bevegelsesuskarphet å teste glomerulær permselectivity synes fordelaktig. Fluorescensmerkete merket Tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (dvs. FITC-Ficoll), kan brukes til å studere glomerulær permselectivity. FITC-polysucrose molekyler er fritt filtrert av glomerulus men ikke reabsorberes i rørformede systemet. I mus og rotter, FITC-polysucrose har blitt undersøkt i modeller av glomerulær permeabilitet ved hjelp av teknisk komplekse prosedyrer (dvs. radioaktive målinger, høy ytelse væske kromatografi [HPLC], gel filtrering). Vi har endret og tilrettelagt en FITC-polysucrose Tracer-basert protokoll for å teste tidlig og små økninger i glomerulær permeabilitet til FITC-polysucrose 70 (størrelsen av albumin) i mus. Denne metoden tillater repeterende urin analyser med små urin mengder (5 μL). Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan Tracer FITC-polysucrose 70 brukes intravenøst og urin er samlet inn via en enkel urin kateter. Urin analyseres via en fluorescens plate leser og normalisert til en urin konsentrasjon markør (kreatinin), og dermed unngår teknisk komplekse prosedyrer.
Funksjonelle eller strukturelle defekter innenfor glomerulær filtrerings barriere øke glomerulær permeabilitet til albumin, noe som resulterer i påvisning av albumin i urinen (albuminuri). Albuminuri spår kardiovaskulære utfall og er en viktig markør for glomerulær Kader1. Selv lave nivåer av albuminuri, ligger innenfor normalområdet, er forbundet med økt kardiovaskulær risiko1.
Under fysiologiske forhold, er albumin filtrert gjennom glomerulus og er nesten helt reabsorberes i rørformede system2,3. I mus, påvisning av albumin i urinen er vanligvis utført av en albumin enzym-knyttet immunosorbentanalyse analysen (ELISA) fra 24 h av urin samling. Hvis urin fra en 24 h urin samling eller flekk urin brukes, små forskjeller i albumin konsentrasjoner kan bli savnet på grunn av analysen følsomhet problemer. De fleste forskere derfor bruke dyremodeller der albuminuri er indusert av robust nyreskader på grunn av giftstoffer, narkotika, og nyre kirurgi.
Derfor er funn av en følsom metode for å oppdage små og forbigående endringer i glomerulær permeabilitet svært viktig for feltet. Rippe et al. har presentert en rotte modell for å teste glomerulær permeabilitet ved å bruke en fluorescensmerkete merket Tracer, nemlig FITC-polysucrose 70 (dvs. FITC-Ficoll 70), på størrelse med albumin4. Den Tracer programmet tillater testing av kortsiktige endringer i glomerulær permeabilitet (i løpet av minutter) og er svært følsom4. To studier har brukt Tracer metoden i mus5,6. Til tross for sine fordeler, denne metoden, dessverre, har ulemper: det er teknisk svært kompleks, radioaktiv, og invasiv. Ytterligere analyse av urinen oppnås bare ved bruk av gel-filtrering eller størrelsesekskludering HPLC.
Innenfor dette papiret, presenterer vi en alternativ, følsom, radioaktivt, og rask metode for å måle glomerulær permeabilitet i mus ved hjelp av fluorescensmerkete merket FITC-polysucrose 70. Ved å innføre et Transurethral kateter, urin samling er mindre invasiv enn blære punktering, urethrotomy, og suprapubisk kateter søknad, og tillater urin samling minst hver 30 min. urin analyse utføres fra små mengder (5μL) ved hjelp av en fluorescerende plate leser. Tracer konsentrasjoner i urinen er normalisert til kreatinin konsentrasjoner i urinen ved hjelp av en enzymatisk kreatinin analysen.
Derfor, denne romanen metoden tilbyr et følsomt verktøy for å studere tidlig glomerulær skade med økt glomerulær permeabilitet.
Den presenterte metoden gjør det mulig for etterforsker å teste glomerulær permeabilitet i mus på en svært følsom måte ved hjelp av en Tracer. Med denne metoden, kortsiktige økninger i glomerulær permeabilitet kan diagnostiseres ved hjelp av bare små mengder urin. De mest kritiske trinnene for vellykket mestring denne teknikken er 1) utvikle manuell ekspertise i musen kirurgi, spesielt i kanyleringen av en sentral vene, 2) plassere urin kateter uten å skade slimhinnen, og 3) manuell ekspertise i håndtering 38…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Christina Schwandt, Blanka Duvnjak, og Nicola Kuhr for deres eksepsjonelle tekniske assistanse og Dr. Dennis Sohn for hans hjelp med fluorescens Scan. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 til L.C.R. og L.S. Funder hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |