Высокочувствительная измерение гломерулярной проницаемости у мышей с флуоресцеином изотиоцианат-полисукроз 70
Summary
Здесь мы представляем протокол для проверки glomerular проницаемости у мышей с помощью высокочувствительных, нерадиоактивных трассировщик. Этот метод позволяет проводить повторные анализы мочи с небольшими объемами мочи.
Abstract
Потеря альбумина в моче (альбуминурия) предсказывает сердечно-сосудистый исход. В физиологических условиях, небольшое количество альбумина фильтруется гломерулем и поглощается в трубчатой системе до достижения предела поглощения. Раннее увеличение патологической фильтрации альбумина может, таким образом, быть пропущено при анализе альбуминурии. Поэтому использование трассеров для проверки гломерулярной пермякции представляется выгодным. Флуоресцентно помеченный трассик флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-полисукроз (т.е. FITC-Ficoll), может быть использован для изучения гломерулярной пермской вертики. Молекулы FITC-полисурозы свободно фильтруются гломерулем, но не поглощаются в трубчатой системе. У мышей и крыс, FITC-полисукроз был исследован в моделях гломерулярной проницаемости с помощью технически сложных процедур (т.е. радиоактивных измерений, высокопроизводительных жидких хроматографии (HPLC), фильтрации геля). Мы модифицировали и облегчили FITC-полисахарозный протокол на основе трассировщика для раннего и небольшого увеличения гломерулярной проницаемости fitC-polysucrose 70 (размер альбумина) у мышей. Этот метод позволяет проводить повторные анализы мочи с небольшими объемами мочи (5 кЛ). Этот протокол содержит информацию о том, как трассировщик FITC-полисукроз 70 применяется внутривенно и моча собирается с помощью простого мочевого катетера. Моча анализируется с помощью флуоресценционного считывателя пластин и нормализуется до маркера концентрации мочи (креатинин), тем самым избегая технически сложных процедур.
Introduction
Функциональные или структурные дефекты в пределах гломерулярного барьера фильтрации увеличивают гломерулярную проницаемость альбумина, в результате чего обнаружение альбумина в моче (альбуминурия). Альбуминурия предсказывает сердечно-сосудистые результаты и является важным маркером для glomerular травмы1. Даже низкие уровни альбуминурии, лежащие в пределах нормального диапазона, связаны с повышенным сердечно-сосудистым риском1.
В физиологических условиях альбумин фильтруется через гломерулус и почтиполностью поглощается в трубчатой системе 2,3. У мышей, обнаружение альбумина в моче, как правило, осуществляется альбумина фермент-связанных иммуносорбент анализа (ELISA) от 24 ч сбора мочи. Если моча из 24 ч мочи или пятно мочи используется, небольшие различия в концентрации альбумина могут быть упущены из-за проблем с чувствительностью анализа. Большинство исследователей, таким образом, используют животные модели, в которых альбуминурия индуцируется надежной почечной травмы из-за токсинов, наркотиков и почечной хирургии.
Таким образом, поиск чувствительного метода для обнаружения небольших и переходных изменений в гломерулярной проницаемости очень важен для поля. Rippe et al. представили крысиную модель для проверки гломерулярной проницаемости, применяя флуоресцентно помеченный трассировщик, а именно FITC-polysucrose 70 (т.е. FITC-Ficoll 70), размером с альбумин4. Приложение трассировщик позволяет тестирование краткосрочных изменений в glomerular проницаемость (в течение нескольких минут) и очень чувствительны4. Два исследования использовали метод трассировщика у мышей5,6. Несмотря на свои преимущества, этот метод, к сожалению, имеет недостатки: он технически очень сложный, радиоактивный и инвазивный. Дальнейший анализ мочи осуществляется только с помощью гель фильтрации или размера исключения HPLC5,6.
В этой работе мы представляем альтернативный, чувствительный, нерадиоактивный и быстрый метод измерения гломерулярной проницаемости у мышей с помощью флуоресцентно помеченного FITC-полисуроз7. Вводя трансуретральный катетер, сбор мочи является менее инвазивным, чем прокол мочевого пузыря, уретотомия и супрапубического катетера применения, и позволяет сбор мочи по крайней мере каждые 30 минут. Анализ мочи выполняется из небольших количествах (5 л) с использованием флуоресцентный считыватель пластин. Концентрации трейда в моче нормализуются до креатинина концентрации в моче с помощью ферментативного анализа креатинина.
Таким образом, этот новый метод предлагает чувствительный инструмент для изучения ранней гломерулярной травмы с повышенной гломерулярной проницаемости.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный метод позволяет исследователю проверить glomerular проницаемость у мышей в очень чувствительным образом с помощью трассировщика. С помощью этого метода, краткосрочное увеличение гломерулярной проницаемости может быть диагностировано с использованием только небольшое ко?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Кристину Швандт, Бланку Дувняк и Николу Кур за исключительную техническую помощь и доктора Денниса Сона за помощь в сканировании флуоресценции. Это исследование было поддержано грантом Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 в Л.К.Р. и Л.С. Фонднера не принимала никакого значения в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
Riferimenti
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
