Vi præsenterer en protokol for at opbygge molekylære pendulkørsler, hvor overflade-overholdt kinesin motor proteiner fremdrive dye-mærket mikrotubuli. Svage interaktioner i kinesins med overfladen giver deres reversible tilknytning til det. Dette skaber en nanoskala system, der udstiller dynamisk samling og demontering af dens komponenter samtidig bevare dens funktionalitet.
Denne protokol beskriver, hvordan du opretter kinesin-drevne molekylære pendulfart med en svag og reversible udlæg i kinesins overflade. I modsætning til tidligere protokoller i dette system, mikrotubuli rekruttere kinesin motor proteiner fra løsningen og placere dem på en overflade. Kinesins vil til gengæld lette gliding af mikrotubuli langs overfladen før desorbing tilbage i bulk løsning, således at være til rådighed til at blive ansat igen. Denne kontinuerlige montering og demontering fører til slående dynamiske opførsel i systemet, såsom dannelsen af midlertidige kinesin stier af svæveflyvning mikrotubuli.
Flere eksperimentelle metoder vil blive beskrevet i hele dette eksperiment: UV-Vis spektrofotometri vil blive brugt til at bestemme koncentrationen af stamopløsninger af reagenser, coverslips vil først blive ozon og ultraviolet (UV) behandlet og derefter TOT silaniseret før monteres i flow celler og total interne reflection fluorescens bruges (JOHANNAS) mikroskopi til samtidigt billede kinesin motors og mikrotubulus filamenter.
De interaktioner, der regulerer funktionen af aktive nanosystemer har altid været præget af langlivet, næsten uoprettelige obligationer1,2,3,4,5,6 ,7,8. En velundersøgte eksempel på dette er mikrotubulus-kinesin system, hvor gliding mikrotubuli er fremdrives ved uigenkaldeligt overflade-bundet kinesin motorer1,2,3,4, 5. Systemer, hvori komponenterne er reversibelt forbundet til hinanden har været undersøgt teoretisk9,10 og gennemføres på overordnet11,12, men skalering disse systemer ned til den nanoskala har været udfordrende. En af de vigtigste grunde til dette er at bryde og reformere obligationer mellem komponenter ofte kræver store ændringer i de miljømæssige forhold. Selvom sådanne ændringer er blevet gennemført i de sidste13,14,15, ville de afhængige ændre selve systemet i stedet for at tilpasse den til sine omgivelser. Designe Molekylær-skala systemer hvor komponenter løbende samle og omorganisere i strukturer uden at forstyrre det generelle miljø, hvori forsøgene finder sted vil åbne døren til udforskningen af en bred vifte af dynamisk adfærd 16 , 17.
Her, vi beskriver og viser detaljerede protokollen for at oprette en dynamisk samling og adskillelse system fungerer på nanoskalaen. Systemet og dets generelle opførsel er blevet indført tidligere18: mikrotubulus filamenter er fremdrives ved spor af reversibelt overflade-bundet kinesin-1 motorer. Disse kinesin motor proteiner er rekrutteret fra løsning til at hjælpe fremdrive mikrotubuli frem, før desorbing igen kort tid bagefter. Når tilbage i løsning, kan de ansættes igen til at fremdrive en ny mikrotubulus. I de sidste13,14,,kræves15, breaking og reform af obligationer miljømæssige ændringer; Derimod forbliver miljø for vores flow celle uændret, mens kinesin motors interagere med overfladen.
Denne protokol vil hjælpe interesserede forskere til (1) visualisere alle trin i protokollen, og (2) hjælpe med fejlfinding af denne type analyse. Det er afledt af de procedurer, der er beskrevet i Howard et al. 199319.
I dette arbejde præsenterer vi en aktiv nanoskala system som self samler svagt-bindende byggesten for at konstruere sit eget spor. Som vist i figur 1, svæveflyvning mikrotubuli akkumulere kinesin motorer fra løsning og deponere dem på overfladen. Kinesin motors forbliver i kølvandet på mikrotubulus for en kort periode før han vendte tilbage til løsning. Således i dette eksperiment motorer kinesin alternativ mellem 3 stater:
(1) en mikrotubulus single-bundet tilstand: Dette er, når en kinesin først bindes til en mikrotubulus. Den findes i ligevægt med staten (2).
(2) en dobbelt-bundet tilstand: i dette tilfælde en mikrotubulus single-bundet kinesin også binder sig til den overflade via sin hans-tag. Denne dobbelt-bundet tilstand giver til mikrotubulus fremdrift.
(3) en enkelt overflade-bundet tilstand: et dobbelt-bundet kinesin, der har gået ud i slutningen af en mikrotubulus og har ikke endnu desorberet fra overfladen er i denne tilstand. Disse motorer kan ses i figur 1 (kombineret og grønne kanaler): de udvide bag halen af mikrotubulus for flere mikrometer og danne sin faldende trail.
Det mest afgørende skridt i denne protokol er dannelsen af den hydrofobe overflade på diaset. Ikke kun bruger den farlige kemikalier, men det giver også mulighed for PIND-PPG-PIND functionalized med gruppen NTA til pels overfladen, som derefter tillader kinesin reversibelt bindes til overfladen. Et andet vigtigt skridt forsegling cellen flow med fedt. Dette giver mulighed for forlænget tænkelig uden væske i flow celle fordamper.
De primære ændringer til denne teknik består af skiftende mikrotubulus koncentration, kinesin koncentration og ATP koncentrationen. Ændre mikrotubulus koncentration vil ændre antallet af mikrotubuli glider på overfladen. Ændring af kinesin koncentration vil ændre antallet af kinesin molekyler, der kan bindes til en mikrotubulus. Men øget kinesin koncentration over de beløb, der allerede er defineret i dette eksperiment kan øge baggrund fluorescens, hvilket gør det sværere at se de kinesin stier efterladt svæveflyvning mikrotubuli. I mellemtiden vil sænke ATP koncentrationer under 10 µM signifikant fald mikrotubulus svæveflyvning hastighed. Hvis denne effekt ønskes, er det nødvendigt at udnytte en ATP regenererende system bestående af kreatin fosfatase og phosphokinase.
En eventuel begrænsning af denne teknik er, at på grund af det store aktive kinesin indholdet af systemet, ATP kan hurtigt forbruges, og eksperimenter kan vare mindre end en time i visse betingelser. Dette ville for eksempel være tilfældet, hvis en brugt en dobbelt højere kinesin koncentration og fem gange højere mikrotubulus koncentration end hvad er præsenteret i denne protokol.
I vores tidligere arbejde18, vi studerede den geografiske fordeling af kinesin motors langs mikrotubuli, bevise at svæveflyvning mikrotubuli akkumulerer kinesin motorer fra løsning, som medfører en forøgelse af tætheden af motors langs længden af den mikrotubulus. Vi fandt også, at mikrotubuli gliding stabilitet viste en ikke-lineær afhængighed af løsning kinesin koncentration og mikrotubulus hastighed.
Præsenteres protokollen baner vejen for en mere effektiv udnyttelse af protein motorer i nanoskala manipuleret systemer og til yderligere undersøgelse i udformningen af aktive nanosystemer, som er i dynamisk ligevægt. Desuden, den dynamiske karakter af dette system gør det muligt at tjene som en model til at studere selvhelende og dynamisk udskiftning af molekylære komponenter, lukke en del af kløften mellem konstruerede og naturlige strukturer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne parlamentsarbejdet finansiel støtte under NSF grant NSF-DMR 1807514. Forfatterne takke G. Bachand og V. Vandelinder for at give normal god landbrugspraksis-kinesin protein. Dette arbejde var udført, delvist på Center for integreret nanoteknologi, en Office of Science bruger Facility drives for os afdeling af Energy (DOE) Office of Science ved Los Alamos National Laboratory (kontrakt nr. DE-AC52-06NA25396) og Sandia National Laboratories (con-tarmkanalen nr. 97 DE-AC04-94AL85000). Forfatterne takke Dr. Jennifer Neff og AllVivo kardiovaskulære for deres gave på PIND-PPG-PIND functionalized med NTA.
488 nm laser | Omicron Laserage | LuxX 488-150 | |
642 nm laser | Omicron Laserage | LuxX 642 | |
Casein | Sigma | C7078-500G | |
Catalase from bovine liver | Sigma | C40-500MG | |
Creatine Phosphate | Sigma | P-7936 | |
Creatine Phosphokinase | Sigma | C3755-500UN | |
D-Glucose | Sigma | G2133-50KU | |
Dichlorodimethylsilane solution | Sigma | 40140-25ML | Toxic |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma | 34869-100ML | |
Dithiothreitol | Sigma | D0632-5G | Toxic |
Eclipse TI | Nikon Instruments | ||
eGFP rkin430 | Provided by George Bachand | ||
EGTA | Sigma | E4378-25G | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Glucose Oxidase | Sigma | G0543-10KU | |
Guanosine Triphosphate | Sigma | G8877-10MG | |
Kimwipes Delicate Task Wipers | Sigma Pharmaceuticals | 8089 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M1028-100ML | |
Methanol | Fisher Chemical | A412 | Toxic |
Milli-Q Water Purification System | Millipore Corporation | ||
Nickel Sulfate | Sigma | 656895-50G | |
Paclitaxel | Sigma | T1912-5MG | |
PIPES | Sigma | P-6757 | |
Pluronic F108-NTA | Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular | PEG-PPG-PEG-NTA | |
Pluronic F-108 | Sigma | 542342-250G | PEG-PPG-PEG |
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 21-403-190 | |
Toluene | Fisher Chemical | T324 | Toxic |
Tubulin, HiLyte647-labeled | Cytoskeleton, Inc. | TL670M | |
UV Ozone Procleaner | BioForce Nanosciences | PC440 | |
Whatman Puradisc syringe filters | Sigma | WHA67840402 | |
Zyla 4.2 sCMOS Camera | Andor Technology | sCMOS 4.2 |