JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

الخميرة كهيكل لتطوير الاختبارات الوظيفية لدراسة P53 الإنسان

Published: August 04, 2019
doi:
10.3791/59071
, , , , ,
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit,Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO,University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy,University of Porto

Summary

عرضت هنا أربعة بروتوكولات لبناء واستغلال الخميرة Saccharomyces cerevisiae سلالات مراسل لدراسة الإنسان P53 إمكانية التنشيط، والآثار من الطفرات المرتبطة بالسرطان المختلفة، والبروتينات المتفاعلة التي أعرب عنها، و آثار جزيئات صغيرة محددة.

Abstract

وقد سمح الاستنتاج بأن بروتين P53 الثدييات المعروفة بمثابة عامل النسخ (TF) في الخميرة S. سيريفيسياي لتطوير تجارب وظيفية مختلفة لدراسة آثار 1) موقع ملزم [أي عنصر الاستجابة (RE)] المتغيرات تسلسل على P53 خصوصية التنشيط أو 2) الطفرات TP53، العوامل المساعدة التي أعرب عنها، أو جزيئات صغيرة على نشاط التعطيل P53. وقد تم تطوير مختلف التطبيقات البحثية الأساسية والترجمة. تجريبيا، هذه النهج استغلال اثنين من المزايا الرئيسية لنموذج الخميرة. فمن ناحية، تتيح سهولة تحرير الجينوم البناء السريع لأنظمة المراسلين النوعية أو الكمية من خلال استغلال السلالات المسببة للسرطان التي لا تختلف إلا على مستوى P53-RE محدد للتحقيق في خصوصية التسلسل للاعتماد على P53 التفعيل. من ناحية أخرى، فإن توافر أنظمة منظمة للتعبير خارج الرحم P53 يسمح بتقييم التنشيط في مجموعة واسعة من التعبير البروتين. يتم مراجعة هذا التقرير على نطاق واسع النظم التي تستند إلى الجينات مراسل اللون، لوسيفيراز، ونمو الخميرة لتوضيح خطواتها المنهجية الرئيسية وتقييم قوة التنبؤ ية. وعلاوة على ذلك، يمكن استغلال التنوع الشديد لهذه النهج بسهولة لدراسة مختلف TFs بما في ذلك P63 و P73، وهما عضوان آخران في عائلة الجينات TP53.

Introduction

النسخ هو عملية معقدة للغاية تنطوي على تنظيم ديناميكي ومكاني وزمني لعوامل النسخ (TFs) والعوامل المساعدة لتوظيف وتعديل بوليميراز الحمض النووي الريبي في مناطق الكروماتين استجابة لمحفزات محددة1 . معظم TFs، بما في ذلك الإنسان P53 قمع الورم، تعترف عناصر محددة cis-acting في شكل تسلسل الحمض النووي تسمى عناصر الاستجابة (REs)، والتي تتكون من زخارف فريدة من نوعها واحدة (أو متعددة) ~ 6-10 النيوكليوتيدات طويلة. ضمن هذه الزخارف، قد تظهر المواقفالفردية درجات مختلفة من التباين 2، وعادة ما تلخصها مصفوفات وزن الموقف (PWM) أو الشعارات3،4.

الخميرة S. cerevisiae هو نظام نموذج مناسب لدراسة جوانب مختلفة من البروتينات البشرية من خلال الاختبارات المكملة، والتعبير خارج الرحم، والاختبارات الوظيفية، حتى عندما يكون جين الخميرة التقويمية غير موجود5، 6 , 7.نظرا للحفظ التطوري للمكونات القاعدية من نظام النسخ8، يمكن للعديد من TFs البشرية (عندما أعرب عن هافيموضعي في خلايا الخميرة) تعديل التعبير عن جين مراسل من خلال العمل من خلال المروجين هندسيا ل تحتوي على REs المناسبة. يتميز نظام نموذج النسخ المعروض هنا لP53 الإنسان بثلاثة متغيرات رئيسية يمكن تعديل آثارها: 1) طريقة التعبير ونوع P53، 2) تسلسل RE السيطرة على النسخ P53 تعتمد، و 3) نوع من [برسّري] مورثة (شكل[1ا]).

وفيما يتعلق بطريقة التعبير P53، يسمح S. cerevisiae باختيار المروجين اللاإمتزاقين أو الكبتأو التأسيسية9و10و11. على وجه الخصوص، المروج GAL1 inducible يسمح القاعدية (باستخدام raffinose كمصدر للكربون) أو متغير (عن طريق تغيير كمية الجالاكتوز في وسائل الإعلام) التعبير عن TF في الخميرة. في الواقع، يمثل التعبير القابل للضبط بدقة تطورا حاسما لدراسة ليس فقط P53 نفسها ولكن أيضا غيرها من البروتينات الأسرة P5312،13.

وفيما يتعلق بنوع REs التي تسيطر على التعبير المعتمد على P53، يسمح S. cerevisiae ببناء سلالات مراسل مختلفة تمتلك اختلافات فريدة في RE من الاهتمام في خلفية غير ذلك من السلالات المسببة للسرطان. يتم التوصل إلى هذا الهدف باستخدام التكيف مع نهج تحرير الجينوم تنوعا بشكل خاص وضعت في S. سيريفيسياي, ودعا ديليتو بيرفيتو12,14,15,16.

وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام جينات مراسل مختلفة (أي URA3، HIS3، وADE2) لتقييم نوعي او كمي للأنشطة النسخية للTFs البشرية في S. cerevisiae، ولكل منها ميزات محددة يمكن أن أن تكون مصممة لتلبية الاحتياجات التجريبية17،18،19،20،21. التعبير عن هذه الجينات مراسل يمنح uracil, الهستيدين, وprototrophy الادينين, على التوالي. مراسل URA3 لا يسمح بنمو الخلايا في وجود 5-FOA كذلك، وبالتالي يمكن أن يكون اختيار مضاد. نظام مراسل ADE2 لديه ميزة أنه، إلى جانب اختيار التغذية، فإنه يسمح بتحديد خلايا الخميرة التي تعبر عن نوع البرية (أي، وظيفية على التعبير ADE2) أو متحولة (أي، غير وظيفيةعلى ADE2 ) P53 من لون المستعمرة.

على سبيل المثال، خلايا الخميرة التي تعبر عن الجين ADE2 تولد مستعمرات بيضاء الحجم عادة على لوحات تحتوي على كميات محدودة من الأينيبين (2.5-5.0 ملغ / لتر)، في حين أن تلك التي سيئة أو لا تنسخ تظهر على نفس لوحة الأحمر الأصغر (أو الوردي) المستعمرات. ويرجع ذلك إلى تراكم وسيط ة في مسار الأدينين التركيبي الحيوي (أي P-ribosylamino-imidazole، الذي كان يسمى سابقا أمينو-إيميدازول ريبوتيد أو AIR)، والتي يتم تحويلها لتشكيل صبغة حمراء. وقد تم استبدال الجينات مراسل ADE2 على أساس اللون النوعي مع الكمية اليراعة Photinus pyralis (LUC1)12،22. في الآونة الأخيرة، تم الجمع بين مراسل ADE2 مع مراسل lacZ في سهلة لتسجيل، شبه كمية، واختراق مزدوج ة يمكن استغلالها لتصنيف المسوخ P53 وفقا لمستواهم المتبقي من الوظائف 23.

كما تم استخدام مراسلي الفلورسنت مثل EGFP (البروتين الفلورسنت الأخضر المعزز) أو DsRed (ديسكوسوما sp. بروتين الفلورسنت الأحمر) للتقييم الكمي لنشاط التنشيط المرتبط بجميع الطفرات الخاطئة المحتملة في TP53 تسلسل الترميز24. وأخيراً، أدت فرصة الجمع بين المروجين القابلة للضبط للتعبير الأليل P53 مع سلالات الخميرة المسببة للسرطان المختلفة لجين RE و/أو المراسل إلى تطوير مصفوفة بيانات تولد تصنيفاً منقحاً للربط بالسرطان وللجرثومة [ترجم جب53 قدم/الولايات-المتحدة2-و/ الولايات-المتحدة]

وتستخدم النهج المذكورة أعلاه لقياس النشاط النسخي للبروتين P53. ومع ذلك، فإن التعبير عن البرية من نوع P53 في الخميرة S. سيريفيسياي28 وSchizosaccharomyces pombe29 يمكن أن يسبب تأخر النمو، والتي ارتبطت مع خلية دورة اعتقال28،30 أو خلية الموت31. في كلتا الحالتين، يتم تشغيل تثبيط نمو الخميرة عن طريق التعبير P53 عالية، وقد تم ربط هادىر مع التشكيل النسخي المحتمل لجينات الخميرة الذاتية المشاركة في نمو الخلايا. دعم هذه الفرضية، وفقدان وظيفة متحولة P53 R273H لم تتداخل مع نمو خلية الخميرة عندما أعرب عنها في مستويات مماثلة كما البرية من نوع P5332. وعلى العكس من ذلك، تسبب التعبير في الخميرة من متحولة سامة P53 V122A (المعروف عن ارتفاع النشاط النسخي مقارنة مع البرية من نوع P53) تأثير مثبط النمو أقوى من البرية من نوع P5332.

بالإضافة إلى ذلك، ثبت أن MDM2 البشرية كانت قادرة على تثبيط النشاط النسخي P53 الإنسان في الخميرة، وتعزيز في كل مكان والتدهور اللاحق33. وبناء على ذلك، أظهرت قدرة الإنسان MDM2 وMDMX لمنع تثبيط نمو الخميرة الناجمة عن P5332،34. في دراسة إضافية، تم تحديد ارتباط بين النشاط النسخي P53 ومستويات التعبير الأكتين، مع تحديد P53 RE المفترضة في المنبع على جين ACT1 في الخميرة32. باستمرار، تم تعزيز التعبير الأكتين من قبل البرية من نوع P53 وحتى أكثر من ذلك من قبل P53 V122A، ولكن ليس من قبل متحولة P53 R273H. وعلى العكس من ذلك، انخفض تعبير الأكتين بواسطة P53 في الوجود المشترك لمثبطات P53 MDM2، MDMX، أو pifithrin-α (مثبط جزيء صغير من النشاط النسخي P53)، بما يتفق مع النتائج على أساس حقن الخميرة النمو. الأهم من ذلك، أنشأت هذه النتائج علاقة بين تثبيط النمو الناجم عن P53 ودرجة نشاطها في الخميرة، والتي تم استغلالها أيضا لتحديد ودراسة الجزيئات الصغيرة تحوير وظائف P5328،34 , 35.

Protocol

1. بناء سلالات الخميرة مراسل ADE2 أو LUC1 التي تحتوي على RE محددة (yAFM-RE أو yLFM-RE) خط yAFM-ICORE أو yLFM-ICORE سلالة12،14 (ICORE = I ، ISce-I endonuclease تحت GAL1 المروج؛ CO = العداد اختيار URA3؛ RE = مراسل KanMX4 منح مقاومة كانامايسين; الجدول1) من مخزون الجلسرين ب?…

Representative Results

تشييد فى الرّهة الثانية أو LUC1 مراسل سلالات الخميرة وقد تم تكييفdelitto perfettoapproach12،14،15،16 لتمكين بناء سلالات ا…

Discussion

وقد أثبتت الاختبارات القائمة على الخميرة مفيدة للتحقيق في مختلف جوانب وظائف البروتين P53. وهذه الاختبارات حساسة بشكل خاص لتقييم إمكانية نقل P53 نحو المتغيرات من المواقع المستهدفة RE، بما في ذلك تقييم تعدد الأشكال الوظيفية. استخدام الصحفيين اللون، فضلا عن تصغير من اللوسيفيراز التصاق يؤدي إلى…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الاتحاد الأوروبي (صندوق الاتحاد الأوروبي POCI/01/0145/FEDER/007728 من خلال Programa Operacional Factores de Competitividade – COMPETE) والصناديق الوطنية (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia and Ministério da Edção e Ciência) under the اتفاقية الشراكة PT2020 UID/QUI/50006/2019 والمشاريع (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 – POCI-01-0145-FEDER-016581. زمالات FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). وقد تم دعم هذا العمل من قبل Compagnia S. Paolo, Turin, Italy (Project 2017.0526) ووزارة الصحة (المشروع 5×1000 و 2015 و 2016; البحث الحالي 2016). ونشكر بشدة الدكتورة تيريزا لوبيز – أرياس الجبل الأسود (جامعة ترينتو، مختبرات تدريس العلوم التجريبية) على مساعدتها في تسجيل الفيديو.

Materials

L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Ricerca sul cancro. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

Tags

YeastP53TranscriptionReporter GeneAdenine-2Firefly LuciferaseLithium AcetateTransformationPCRSanger SequencingTransactivationColor-based Assay
check_url/it/59071?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image