Il lievito come telaio per lo sviluppo di saggi funzionali per studiare l'Uomo P53

Summary

Sono presentati quattro protocolli per costruire e sfruttare i ceppi di reporter del lievito Saccharomyces cerevisiae per studiare il potenziale di trassessione umano P53, gli impatti delle sue varie mutazioni associate al cancro, le proteine interagenti co-espresse e gli effetti di piccole molecole specifiche.

Abstract

La scoperta che la nota proteina P53 mammifera può fungere da fattore di trascrizione (TF) nel lievito S. cerevisiae ha permesso lo sviluppo di diversi saggi funzionali per studiare l’impatto del sito di legame [cioè, elemento di risposta (RE)] varianti di sequenza sulla specificità di trasattivazione P53 o 2) mutazioni di TP53, co-espressi co-espressi co-espressi o piccole molecole sull’attività di trasattivazione P53. Sono state sviluppate diverse applicazioni di ricerca di base e traslazionali. Sperimentalmente, questi approcci sfruttano due grandi vantaggi del modello di lievito. Da un lato, la facilità di editing del genoma consente una rapida costruzione di sistemi qualitativi o quantitativi di reporter sfruttando ceppi isogenici che differiscono solo a livello di uno specifico P53-RE per studiare la specificità della sequenza dipendente da P53 trasattivazione. D’altra parte, la disponibilità di sistemi regolamentati per l’espressione ectopica P53 consente la valutazione della trasattivazione in una vasta gamma di espressioni proteiche. Rivisti in questa relazione sono ampiamente utilizzati sistemi che si basano sui geni dei reporter di colore, luciferase, e la crescita del lievito per illustrare i loro principali passi metodologici e per valutare criticamente il loro potere predittivo. Inoltre, l’estrema versatilità di questi approcci può essere facilmente sfruttata per studiare diversi TF tra cui P63 e P73, che sono altri membri della famiglia genica TP53.

Introduction

La trascrizione è un processo estremamente complesso che coinvolge l’organizzazione dinamica, spaziale e temporale dei fattori di trascrizione (TF) e dei cofattori per il reclutamento e la modulazione delle polimerasi dell’RNA sulle regioni della cromatina in risposta a stimoli specifici¹ . La maggior parte dei TF, incluso il soppressore umano del tumore P53, riconosce specifici elementi cis-agire sotto forma di sequenze di DNA chiamate elementi di risposta (RE), che consistono in singoli (o multipli) motivi unici lunghi 6-10 nucleotidi. All’interno di questi motivi, singole posizioni possono mostrare vari gradi di variabilità², di solito riassunti da matrici di peso posizione (PWM) o loghi^3,4.

Il lievito S. cerevisiae è un sistema modello adatto per studiare diversi aspetti delle proteine umane attraverso saggi di complemento, espressione ectopica e saggi funzionali, anche quando non è presente un gene di lievito ortologo^{5, 6} È possibile: ^{, 7}. A causa della conservazione evolutiva dei componenti basali del sistema trascrizionale⁸, molti TF umani (espressi ectopicamente in cellule di lievito) possono modulare l’espressione di un gene reporter agendo attraverso promotori progettati per contengono RE appropriate. Il sistema del modello di trascrizione qui presentato per l’uomo P53 è caratterizzato da tre variabili principali i cui effetti possono essere modulati: 1) la modalità di espressione e il tipo di P53, 2) la sequenza RE che controlla la trascrizione dipendente da P53 e 3) il tipo di gene reporter (Figura 1A).

Per quanto riguarda la modalità di espressione P53, S. cerevisiae permette la scelta di promotori inducibili, repressivi o imtenziari^9,10,11. In particolare, il promotore inducibile GAL1 consente basale (utilizzando raffinose come fonte di carbonio) o variabile (cambiando la quantità di galactose nei media) espressione di un TF in lievito. Infatti, l’espressione finemente regolabile rappresenta uno sviluppo critico per lo studio non solo della P53 stessa, ma anche di altre proteine familiari P53^12,13.

Per quanto riguarda il tipo di RE che controlla noto all’espressione dipendente da P53, S. cerevisiae consente la costruzione di diversi ceppi di reporter in possesso di differenze uniche nella RE di interesse in un contesto altrimenti isogenico. Questo obiettivo è raggiunto utilizzando l’adattamento di un approccio di editing del genoma particolarmente versatile sviluppato in S. cerevisiae, chiamato delitto^12,14,15,16.

Inoltre, diversi geni reporter (ad esempio URA3, HIS3 e ADE2) possono essere utilizzati per valutare qualitativamente e quantitativamente le attività trascrizionali dei TF umani in S. cerevisiae, ciascuno con caratteristiche specifiche che possono essere su misura per le esigenze sperimentali^{17,18,19,20,21}. L’espressione di questi geni reporter conferisce uracil, istidina e prototrofia adenina, rispettivamente. Il reporter URA3 non consente la crescita delle cellule in presenza di 5-FOA pure, e quindi può essere controselezionato. Il sistema di reporter ADE2 ha il vantaggio che, oltre alla selezione nutrizionale, consente l’identificazione di cellule di lievito che esprimono di tipo selvaggio (cioè, funzionale su espressione ADE2) o mutanti (cioè,non funzionali su ADE2 ) P53 dal colore della colonia.

Ad esempio, le cellule di lievito che esprimono il gene ADE2 generano colonie bianche di dimensioni normali su lastre contenenti quantità limitanti di adenina (2,5-5,0 mg/L), mentre quelle che non si trascrivono male o non la trascrivono appaiono sulla stessa piastra del rosso più piccolo (o rosa) Colonie. Ciò è dovuto all’accumulo di un intermedio nel percorso biosintetico adenino (ad esempio, P-ribosylamino-imidazole, precedentemente chiamato ribotide amino-imidazole o AIR), che viene convertito per formare un pigmento rosso. Da allora il gene qualitativo del reporter ADE2 basato sul colore è stato sostituito dal quantitativo Firefly Photinus pyralis (LUC1)^12,22. Più di recente, il reporter di ADE2 è stato combinato con il reporter lacz in un’analisi del doppio reporter facile da segnare, semi-quantitativa, che può essere sfruttata per sottoclassificare i mutanti P53 in base al loro livello residuo di funzionalità ²³.

Reporter fluorescenti come EGFP (proteina fluorescente verde avanzata) o DsRed (Discosoma sp. proteina fluorescente rossa) sono stati utilizzati anche per la valutazione quantitativa dell’attività di trasattivazione associata a tutte le possibili mutazioni di Sequenza di codifica TP53²⁴. Infine, la possibilità di combinare promotori regolabili per l’espressione allele P53 con ceppi di lievito isogenici diversi per il gene RE e/o reporter ha portato allo sviluppo di una matrice di dati che genera una classificazione raffinata di lieviti associati al cancro e germinale mutante P53 alleli^25,26,27.

Gli approcci sopra descritti sono utilizzati per misurare l’attività trascrizionale della proteina P53. Tuttavia, l’espressione di P53 di tipo selvaggio nel lievito S. cerevisiae²⁸ e Schizosaccharomyces pombe²⁹ può causare ritardo della crescita, che è stato associato con l’arresto del ciclo cellulare^28,30 o morte cellulare³¹. In entrambi i casi, l’inibizione della crescita del lievito è innescata da un’elevata espressione P53 ed è stata correlata con la potenziale modulazione trascrizionale dei geni del lievito endogeno coinvolti nella crescita cellulare. A sostegno di questa ipotesi, il mutante P53 R273H della perdita di funzione non ha interferito con la crescita delle cellule di lievito quando espresso a livelli simili a P53³²di tipo selvaggio. Al contrario, l’espressione nel lievito del mutante tossico P53 V122A (noto per una maggiore attività trascrizionale rispetto al selvaggio P53) ha causato un effetto inibitorio della crescita più forte rispetto al tipo selvaggio P53³².

Inoltre, è stato dimostrato che l’MDM2 umano è stato in grado di inibire l’attività trascrizionale umana P53 nel lievito, promuovendone l’ubiquitinazione e la conseguente degradazione³³. Di conseguenza, la capacità dell’uomo MDM2 e MDMX di inibire l’inibizione della crescita del lievito indotta da P53 è stata dimostrata^32,34. In uno studio aggiuntivo, è stata stabilita una correlazione tra l’attività trascrizionale P53 e i livelli di espressione dell’actina, con l’identificazione di un putativo P53 RE a monte sul gene ACT1 nel lievito³². Coerentemente, l’espressione di actin è stata potenziata da P53 wild-tipo e ancora di più da P53 V122A, ma non dal mutante P53 R273H. Al contrario, l’espressione di actina da P53 è diminuita nella co-presenza di inibitori P53 MDM2, MDMX, o pifithrin- s (un inibitore di piccole molecole dell’attività trascrizionale P53), coerente con i risultati basati sul saggio di crescita del lievito. È importante sottolineare che questi risultati hanno stabilito una correlazione tra l’inibizione della crescita indotta da P53 e il grado della sua attività nel lievito, che è stato sfruttato anche per identificare e studiare piccole molecole che modulano le funzioni P53^{28,34 , 35}.

Protocol

1. Costruzione di ceppi di lievito reporter ADE2 o LUC1 contenenti un RE specifico (yAFM-RE o yLFM-RE) Streak un ceppo yAFM-ICORE o yLFM-ICORE12,14 (ICORE – ICORE – ISce-I endonuclease sotto promotore di GAL1; CO – contatore selezionabile URA3; RE – reporter KanMX4 conferendo la resistenza alla kanamycin; Tabella 1) da un 15% di brodo di glicerolo immagazzinato a -80 gradi centigradi su una p…

Representative Results

Costruzione di ADE2 o o LUC1 ceppi di lievito reporter Ildelitto perfettoapproach12,14,15,16 è stato adattato per consentire la costruzione di ceppi di lievito reporter P53 ( Figura<strong c…

Discussion

I saggi basati sul lievito si sono dimostrati utili per studiare vari aspetti delle funzioni proteiche P53. Questi saggi sono particolarmente sensibili per valutare il potenziale di trasattivazione P53 verso varianti di siti target RE, compresa la valutazione dei polimorfismi funzionali. L’uso di giornalisti di colore e la miniaturizzazione del saggio luciferasi si traducono in analisi convenienti e relativamente scalabili. Inoltre, il test di inibizione della crescita è potenzialmente suscettibile di essere utilizzato …

Materials

L-Aspartic acid	SIGMA	11189
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
L-Phenylalanine	SIGMA	78019
Peptone	BD Bacto	211677
Yeast ex+A2:C26tract	BD Bacto	212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate	BDTM	233520
Lithium Acetate Dihydrate	SIGMA	517992
Bacteriological Agar Type A	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 disulfate salt	SIGMA	A1720
Ammonium Sulfate	SIGMA	A2939
L-Arginine Monohydro-chloride	SIGMA	A5131
Adenine Hemisulfate Salt	SIGMA	A9126
Passive Lysis Buffer 5x	PROMEGA	E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-Galactose	SIGMA	G0750
L-Glutamic acid	SIGMA	G1251
Dextrose	SIGMA	G7021
L-Histidine	SIGMA	H8125
L-Isoleucine	SIGMA	I2752
L-Lysine	SIGMA	L1262
L-Leucine	SIGMA	L8000
L-Methionine	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate	SIGMA	R0250
L-Serine	SIGMA	S4500
L-Tryptophan	SIGMA	T0271
L-Threonine	SIGMA	T8625
Uracil	SIGMA	U0750
L-Valine	SIGMA	V0500