Gjær som et chassis for å utvikle funksjonelle analyser for å studere Human P53

Summary

Presentert her er fire protokoller for å konstruere og utnytte gjær Saccharomyces cerevisiae reporter stammer å studere menneskelig P53 transactivation potensial, virkninger av sine ulike kreft-tilknyttede mutasjoner, co-uttrykt samspill proteiner, og virkningene av spesifikke små molekyler.

Abstract

Funnet at den velkjente pattedyr P53 protein kan fungere som en transkripsjon faktor (TF) i gjær S. cerevisiae har tillatt for utvikling av ulike funksjonelle analyser for å studere virkningene av 1) bindende nettsted [dvs. respons element (re)] sekvens varianter på P53 transactivation spesifisitet eller 2) TP53 mutasjoner, co-uttrykt kofaktorer, eller små molekyler på P53 transactivation aktivitet. Ulike grunnleggende og translational forskningsprogrammer er utviklet. Eksperimentelt, disse tilnærmingene utnytte to store fordeler av gjær modellen. På den ene siden, den enkle Genova redigering muliggjør rask bygging av kvalitative eller kvantitative reporter systemer ved å utnytte isogenic stammer som avviker bare på nivå med en bestemt P53-RE for å undersøke sekvensen-spesifisitet av P53-avhengige transactivation. På den annen side tillater tilgjengeligheten av regulerte systemer for P53-uttrykk utenfor livmoren evalueringen av transactivation i et bredt spekter av protein uttrykk. Gjennomgått i denne rapporten er mye brukt systemer som er basert på farge reporter gener, luciferase, og veksten av gjær for å illustrere deres viktigste metodisk skritt og for å kritisk vurdere sin prediktiv makt. Dessuten, det ekstrem allsidighet av disse tilnærmelser kan lett utnyttes å studere annerledes TFs inkluderer P63 og P73, hvilke er annet medlemmer av TP53 Gene slekt.

Introduction

Transkripsjon er en svært kompleks prosess som involverer dynamisk, romlig og timelig organisering av transkripsjon faktorer (TFs) og kofaktorer for rekruttering og modulering av RNA polymerases på kromatin regioner som svar på bestemte stimuli¹ . De fleste TFs, inkludert den menneskelige P53 tumor Suppressor, gjenkjenne bestemte CIS-fungerende elementer i form av DNA-sekvenser som kalles respons elementer (REs), som består av enkle (eller flere) unike motiver ~ 6-10 nukleotider lang. Innenfor disse motivene, kan individuelle posisjoner viser ulike grader av variasjon², vanligvis oppsummert etter posisjon vekt matriser (PWM) eller logoer^3,4.

Den gjær S. cerevisiae er et egnet modell system for å studere ulike aspekter av humane proteiner gjennom komplementering analyser, svangerskap utenfor livmoren, og funksjonelle analyser, selv når en orthologous gjær genet ikke er tilstede^{5, 6} andre priser ^{, 7}. på grunn av den evolusjonære bevaring av basal komponenter av transcriptional system⁸, mange menneskelige TFs (når jektopicheski uttrykt i gjærceller) kan modulere uttrykk for en reporter genet ved å handle gjennom arrangører konstruert for å inneholder passende REs. Den transkripsjon modellen systemet presenteres her for menneskelig P53 er preget av tre store variabler som effekter kan modulert: 1) den modalitet av uttrykk og type P53) på RE sekvensen kontrollerende P53-avhengige transkripsjon, og 3) type et reporter gen (figur 1a).

Om modalitet av P53 uttrykk, S. cerevisiae tillater valg av induserbart, repressible, eller konstituerende arrangører^9,10,11. Spesielt den induserbart GAL1 arrangøren tillater basal (ved hjelp raffinose som en karbon kilde) eller variabel (ved å endre mengden galaktose i Media) uttrykk for en TF i gjær. Faktisk representerer fint tunable uttrykk en kritisk utvikling for å studere ikke bare P53 seg selv, men også andre P53 familie proteiner^12,13.

Når det gjelder type REs kontrollere det P53-avhengige uttrykket, S. cerevisiae tillater bygging av ulike reporter stammer inneha unike forskjeller i re av interesse i en ellers isogenic bakgrunn. Dette målet er nådd ved hjelp av en tilpasning av en spesielt allsidig Genova redigering tilnærming utviklet i S. cerevisiae, kalt delitto perfetto^12,14,15,16.

Videre kan ulike reporter gener (dvs. URA3, HIS3, og ADE2) brukes til kvalitativt og kvantitativt evaluere Transcriptional aktiviteter av menneskelig TFs i S. cerevisiae, hver med bestemte funksjoner som kan skreddersys til eksperimentelle behov^{17,18, 19,20,21}. Uttrykket av disse reporter gener gir henholdsvis uracil, histidin og adenine prototrophy. Den URA3 reporter tillater ikke veksten av celler i nærvær av 5-Foa også, og dermed kan det være counterselected. Den ADE2 reporter systemet har den fordelen at, foruten ernæringsmessige utvalg, tillater det identifisering av gjærceller som uttrykker vill-type (dvs. funksjonell på ADE2 Expression) eller mutant (dvs.ikke funksjonell på ADE2 ) P53 fra kolonien farge.

For eksempel, gjærceller uttrykker ADE2 genet generere normalt størrelse hvite kolonier på plater som inneholder begrensende mengder adenine (2.5-5.0 mg/L), mens de som dårlig eller ikke transkribere det vises på samme plate som mindre rød (eller rosa) Koloniene. Dette skyldes akkumulering av en mellomliggende i adenine biosyntetiske veien (dvs. P-ribosylamino-imidazole, som tidligere har blitt kalt amino-imidazole ribotide eller AIR), som er konvertert til å danne en rød pigment. Den kvalitative farge basert ADE2 reporter genet har siden blitt erstattet med den kvantitative Firefly Photinus pyralis (LUC1)^12,22. Flere nylig har ADE2 reporter blitt kombinert med lacZ reporter i en lett-å-score, semi-kvantitative, Double reporter analysen som kan utnyttes til sub-klassifisere P53 mutanter i henhold til deres gjenværende nivå av funksjonalitet ²³på.

Fluorescerende journalister som EGFP (forbedret grønt fluorescerende protein) eller DsRed (Discosoma Sp. rødt fluorescerende protein) har også blitt brukt til den kvantitative evalueringen av transactivation aktivitet forbundet med alle mulige missense mutasjoner i TP53 koding sekvens²⁴. Endelig, sjansen for å kombinere tunable arrangører for P53 allel uttrykk med isogenic gjær stammer ulik for RE og/eller reporter genet har ført til utviklingen av en data matrise som genererer en raffinert klassifisering av kreft-assosiert og germline mutant P53 alleler^25,26,27.

Fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, brukes til å måle den transcriptional aktiviteten til P53-proteinet. Men uttrykket av Wild-type P53 i gjær S. cerevisiae²⁸ og Schizosaccharomyces pombe²⁹ kan forårsake vekst retardasjon, som har vært forbundet med celle syklus arrest^28,30 eller celle død³¹. I begge tilfeller, gjær veksthemming utløses av høy P53 uttrykk og har vært korrelert med potensielle transcriptional modulering av endogene gjær gener involvert i cellevekst. Støtter denne hypotesen, tap-of-Function mutant P53 R273H ikke forstyrrer gjær cellevekst når uttrykt på lignende nivåer som vill-type P53³². Omvendt, uttrykket i gjær av giftige mutant P53 V122A (kjent for høyere transcriptional aktivitet i forhold til vill-type P53) forårsaket en sterkere veksthemmende effekt enn vill-type P53³².

I tillegg ble det demonstrert at menneskelige MDM2 var i stand til å hemme den menneskelige P53 transcriptional aktivitet i gjær, fremme sin ubiqitinering og påfølgende degradering³³. Følgelig, evne til menneskelig MDM2 og MDMX å hemme P53-indusert gjær veksthemming ble demonstrert^32,34. I en ekstra studie ble en sammenheng mellom P53 transcriptional aktivitet og utgangen uttrykks nivåer etablert, med identifisering av en antatte P53 RE oppstrøms på ACT1 genet i gjær³². Konsekvent, utgangen uttrykk ble forsterket av vill-type P53 og enda mer av P53 V122A, men ikke av mutant P53 R273H. Omvendt, utgangen uttrykk ved P53 redusert i co-tilstedeværelsen av P53-hemmere MDM2, MDMX, eller pifithrin-α (en liten-molekyl hemmer av P53 transcriptional aktivitet), i samsvar med resultater basert på gjær-vekst analysen. Viktigst, disse resultatene etablerte en sammenheng mellom P53-indusert veksthemming og graden av sin aktivitet i gjær, som også har blitt utnyttet til å identifisere og studere små molekyler modulerende P53 funksjoner^{28,34 ,} i ³⁵.

Protocol

1. bygging av ADE2 eller LUC1 reporter gjær stammer som inneholder en bestemt RE (YAFM-RE eller yLFM-re) Strek en yAFM-ICORE eller yLFM-ICORE belastning12,14 (ICORE = I, ISce-I endonuclease under GAL1 promoter; CO = Counter valgbar URA3; RE = reporter KanMX4 overdragelse kanamycin motstand; Tabell 1) fra en 15% glyserol aksjer lagret ved-80 ° c på en YPDA agar plate (tabell 2</stro…

Representative Results

Byggingen av ADE2 eller LUC1 reporter gjær stammer Dendelitto perfettoapproach12,14,15,16 er blitt tilpasset for å muliggjøre bygging av P53 reporter gjær stammer (fi…

Discussion

Gjær-baserte analyser har vist seg nyttig å undersøke ulike aspekter av P53 protein funksjoner. Disse analysene er spesielt følsomme for å evaluere P53 transactivation potensiale mot varianter av RE målområder, inkludert evaluering av funksjonell polymorfismer. Bruk av farge journalister samt miniatyrisering av luciferase analysen resultere i kostnadseffektiv og relativt skalerbar analyser. Dessuten er veksten hemming testen potensielt mottagelig for å bli brukt i kjemiske biblioteket screening, automatisere kvan…

Materials

L-Aspartic acid	SIGMA	11189
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
L-Phenylalanine	SIGMA	78019
Peptone	BD Bacto	211677
Yeast ex+A2:C26tract	BD Bacto	212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate	BDTM	233520
Lithium Acetate Dihydrate	SIGMA	517992
Bacteriological Agar Type A	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 disulfate salt	SIGMA	A1720
Ammonium Sulfate	SIGMA	A2939
L-Arginine Monohydro-chloride	SIGMA	A5131
Adenine Hemisulfate Salt	SIGMA	A9126
Passive Lysis Buffer 5x	PROMEGA	E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-Galactose	SIGMA	G0750
L-Glutamic acid	SIGMA	G1251
Dextrose	SIGMA	G7021
L-Histidine	SIGMA	H8125
L-Isoleucine	SIGMA	I2752
L-Lysine	SIGMA	L1262
L-Leucine	SIGMA	L8000
L-Methionine	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate	SIGMA	R0250
L-Serine	SIGMA	S4500
L-Tryptophan	SIGMA	T0271
L-Threonine	SIGMA	T8625
Uracil	SIGMA	U0750
L-Valine	SIGMA	V0500