Levadura como chasis para el desarrollo de ensayos funcionales para estudiar P53 humanos

Summary

Aquí se presentan cuatro protocolos para construir y explotar cepas de reporteros de Saccharomyces cerevisiae para estudiar el potencial de transactivación P53 humano, los impactos de sus diversas mutaciones asociadas al cáncer, las proteínas interexpresas que interactúan y las proteínas interexpresas que interactúan, y los efectos de moléculas pequeñas específicas.

Abstract

La constatación de que la conocida proteína P53 de mamíferopuede actuar como un factor de transcripción (TF) en la levadura S. cerevisiae ha permitido el desarrollo de diferentes ensayos funcionales para estudiar los impactos de 1) sitio de unión [es decir, elemento de respuesta (RE)] variantes de secuencia en la especificidad de la transactivación P53 o 2) mutaciones TP53, cofactores co-expresados o moléculas pequeñas en la actividad de transactivación P53. Se han desarrollado diferentes aplicaciones de investigación básica straslacional. Experimentalmente, estos enfoques aprovechan dos grandes ventajas del modelo de levadura. Por un lado, la facilidad de edición del genoma permite la construcción rápida de sistemas de reporteros cualitativos o cuantitativos mediante la explotación de cepas isogénicas que difieren sólo a nivel de un P53-RE específico para investigar la especificidad de la secuencia de P53 dependiente transactivación. Por otro lado, la disponibilidad de sistemas regulados para la expresión ectópica P53 permite la evaluación de la transactivación en una amplia gama de expresión proteica. En este informe se revisan sistemas ampliamente utilizados que se basan en genes de reporteros de color, luciferasa, y el crecimiento de la levadura para ilustrar sus principales pasos metodológicos y evaluar críticamente su poder predictivo. Además, la versatilidad extrema de estos enfoques se puede explotar fácilmente para estudiar diferentes TF, incluyendo P63 y P73, que son otros miembros de la familia de genes TP53.

Introduction

La transcripción es un proceso extremadamente complejo que implica la organización dinámica, espacial y temporal de factores de transcripción (TF) y cofactores para el reclutamiento y modulación de arnmerasas en regiones de cromatina en respuesta a estímulos específicos¹ . La mayoría de los TF, incluido el supresor de tumores P53 humano, reconocen elementos específicos de acción cis en forma de secuencias de ADN llamadas elementos de respuesta (RE), que consisten en motivos únicos (o múltiples) únicos de 6-10 de largo. Dentro de estos motivos, las posicionesindividuales pueden mostrar varios grados de variabilidad 2, generalmente resumidos por matrices de peso de posición (PWM) o logotipos^3,4.

La levadura S. cerevisiae es un sistema modelo adecuado para el estudio de diferentes aspectos de las proteínas humanas a través de ensayos de complementación, expresión ectópica y ensayos funcionales, incluso cuando un gen de levadura ortopélogono no está presente^{5, 6 , 7}. Debido a la conservación evolutivade los componentes basales del sistema transcripcional 8, muchos TF humanos (cuando se expresan ectopticamente en células de levadura) pueden modular la expresión de un gen reportero actuando a través de promotores contienen REE apropiados. El sistema de modelo de transcripción presentado aquí para P53 humano se caracteriza por tres variables principales cuyos efectos pueden ser modulados: 1) la modalidad de expresión y el tipo de P53, 2) la secuencia RE que controla la transcripción dependiente de P53, y 3) el tipo de gen del reportero (Figura1A).

En cuanto a la modalidad de expresión P53, S. cerevisiae permite la elección de promotores inducibles, represibles o constitutivos^9,10,11. En particular, el promotor inducible GAL1 permite la expresión basal (usando la rafinosa como fuente de carbono) o variable (cambiando la cantidad de galactosa en los medios) de un TF en la levadura. De hecho, la expresión finamente ajustable representa un desarrollo crítico para el estudio no sólo P53 sí mismo, sino también otras proteínas de la familia P53^12,13.

En cuanto al tipo de RE que controlan la expresión dependiente de P53, S. cerevisiae permite la construcción de diferentes cepas de reportero que poseen diferencias únicas en el RE de interés en un fondo isogénico. Este objetivo se alcanza mediante una adaptación de un enfoque de edición del genoma particularmente versátil desarrollado en S. cerevisiae,llamado delitto perfetto^12,14,15,16.

Además, se pueden utilizar diferentes genes de reportero (es decir, URA3, HIS3 y ADE2) para evaluar cualitativa y cuantitativamente las actividades transcripcionales de los FE humanos en S. cerevisiae,cada uno con características específicas que pueden adaptarse a las necesidades experimentales^{17,18,19,20,21}. La expresión de estos genes reportero confiere uracilo, histidina y protrotrofia de adenina, respectivamente. El reportero de URA3 no permite el crecimiento de células en presencia de 5-FOA también, y por lo tanto puede ser contraseleccionado. El sistema de reporteros ADE2 tiene la ventaja de que, además de la selección nutricional, permite la identificación de células de levadura que expresan tipo salvaje (es decir, funcional en expresión ADE2) o mutantes (es decir,no funcionales en ADE2 ) P53 del color de la colonia.

Por ejemplo, las células de levadura que expresan el gen ADE2 generan colonias blancas de tamaño normal en placas que contienen cantidades limitantes de adenina (2,5-5,0 mg/L), mientras que las que pobremente o no transcriben aparecen en la misma placa que el rojo más pequeño (o rosa) Colonias. Esto se debe a la acumulación de un intermedio en la vía biosintética de adenina (es decir, P-ribosylamino-imidazol, que anteriormente se ha llamado amino-imidazol ribotida o AIR), que se convierte para formar un pigmento rojo. El gen cualitativo reportero ADE2 basado en color ha sido reemplazado por el cuantitativo Firefly Photinus pyralis (LUC1)^12,22. Más recientemente, el reportero de ADE2 se ha combinado con el reportero de lacZ en un ensayo de reportero doble, semicuantitativo y fácil de obtener que puede ser explotado para subclasificar mutantes P53 de acuerdo con su nivel residual de funcionalidad ²³.

También se han utilizado reporteros fluorescentes como EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) o DsRed (Discosoma sp. proteína fluorescente roja) para la evaluación cuantitativa de la actividad de transactivación asociada con todas las posibles mutaciones de SECUENCIA de codificación TP53²⁴. Por último, la posibilidad de combinar promotores ajustables para la expresión de alelo P53 con cepas de levadura isogénicas diferentes para el gen RE y/o reportero ha llevado al desarrollo de una matriz de datos que genera una clasificación refinada de las cepas de mutantes P53 alelos^25,26,27.

Los enfoques descritos anteriormente se utilizan para medir la actividad transcripcional de la proteína P53. Sin embargo, la expresión de tipo salvaje P53 en la levadura S. cerevisiae²⁸ y Schizosaccharomyces pombe²⁹ puede causar retraso en el crecimiento, que se ha asociado con la detención del ciclo celular^28,30 o muerte celular³¹. En ambos casos, la inhibición del crecimiento de la levadura se desencadena por una alta expresión de P53 y se ha correlacionado con la posible modulación transcripcional de genes de levadura endógenos implicados en el crecimiento celular. Apoyando esta hipótesis, el mutante de pérdida de función P53 R273H no interfirió con el crecimiento de las células de levadura cuando se expresa en niveles similares a P53³²de tipo salvaje. Por el contrario, la expresión en levadura del mutante tóxico P53 V122A (conocido por una mayor actividad transcripcional en comparación con el tipo salvaje P53) causó un efecto inhibidor del crecimiento más fuerte que el tipo salvaje P53^32.

Además, se demostró que el MDM2 humano fue capaz de inhibir la actividad transcripcional humana P53 en la levadura, promoviendo su ubiquitinación y posterior degradación³³. En consecuencia, se demostró la capacidad de MDM2 humano y MDMX para inhibir la inhibición del crecimiento de levadura inducida por P53^32,34. En un estudio adicional, se estableció una correlación entre la actividad transcripcional P53 y los niveles de expresión de actina, con la identificación de un putativo P53 RE aguas arriba en el gen ACT1 en la levadura^32. Consistentemente, la expresión de actina fue mejorada por P53 de tipo salvaje y aún más por P53 V122A, pero no por el mutante P53 R273H. Por el contrario, la expresión de actina por P53 disminuyó en la copresencia de inhibidores de P53 MDM2, MDMX o pifithrin-o (un inhibidor de molécula pequeña de la actividad transcripcional P53), consistente con resultados basados en el ensayo de crecimiento de levadura. Es importante destacar que estos resultados establecieron una correlación entre la inhibición del crecimiento inducida por P53 y el grado de su actividad en la levadura, que también ha sido explotada para identificar y estudiar moléculas pequeñas que modulan las funciones P53^{28,34 , 35}.

Protocol

1. Construcción de cepas de levadura de reportero ADE2 o LUC1 que contengan un RE específico (yAFM-RE o yLFM-RE) Racha una cepa yAFM-ICORE o yLFM-ICORE12,14 (ICORE – I, ISce-I endonucleasa bajo el promotor GAL1; CO – contador seleccionable URA3; RE – reportero KanMX4 que confiere resistencia a la kanamicina; Tabla 1) de un stock de glicerol del 15% almacenado a -80 oC en una placa de agar Y…

Representative Results

Construcción de ADE2 o LUC1 reportero tensións de levadura Eldelitto perfettoapproach12,14,15,16 ha sido adaptado para permitir la construcción de cepas de levadura de reportero P53 (Figur…

Discussion

Los ensayos a base de levadura han demostrado ser útiles para investigar varios aspectos de las funciones de la proteína P53. Estos ensayos son particularmente sensibles para evaluar el potencial de transactivación De53 hacia variantes de sitios objetivo RE, incluida la evaluación de polimorfismos funcionales. El uso de reporteros de color, así como la miniaturización del ensayo de luciferasa resultan en ensayos rentables y relativamente escalables. Además, la prueba de inhibición del crecimiento es potencialment…

Materials

L-Aspartic acid	SIGMA	11189
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
L-Phenylalanine	SIGMA	78019
Peptone	BD Bacto	211677
Yeast ex+A2:C26tract	BD Bacto	212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate	BDTM	233520
Lithium Acetate Dihydrate	SIGMA	517992
Bacteriological Agar Type A	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 disulfate salt	SIGMA	A1720
Ammonium Sulfate	SIGMA	A2939
L-Arginine Monohydro-chloride	SIGMA	A5131
Adenine Hemisulfate Salt	SIGMA	A9126
Passive Lysis Buffer 5x	PROMEGA	E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-Galactose	SIGMA	G0750
L-Glutamic acid	SIGMA	G1251
Dextrose	SIGMA	G7021
L-Histidine	SIGMA	H8125
L-Isoleucine	SIGMA	I2752
L-Lysine	SIGMA	L1262
L-Leucine	SIGMA	L8000
L-Methionine	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate	SIGMA	R0250
L-Serine	SIGMA	S4500
L-Tryptophan	SIGMA	T0271
L-Threonine	SIGMA	T8625
Uracil	SIGMA	U0750
L-Valine	SIGMA	V0500