Jäst som chassi för att utveckla funktionella analyser för att studera humant p53

Summary

Presenteras här är fyra protokoll för att konstruera och exploatera jäst Saccharomyces cerevisiae reporter stammar att studera humant p53 transaktiveringspotential, effekterna av dess olika cancerrelaterade mutationer, Co-uttryckta samverkande proteiner, och effekterna av specifika små molekyler.

Abstract

Konstaterandet att det välkända proteinet hos däggdjur p53 kan fungera som en transkriptionsfaktor (TF) i jästen S. cerevisiae har tillåtit utveckling av olika funktionella analyser för att studera effekterna av 1) bindnings plats [dvs., responselement (re)] sekvenvarianter på p53-transaktiveringselektivitet eller 2) TP53 -mutationer, Co-uttryckta kofaktorer eller små molekyler på p53-transaktiveringsaktivitet. Olika grundläggande och translationella forskningstillämpningar har utvecklats. Experimentellt, dessa metoder utnyttja två stora fördelar med jästen modell. Å ena sidan möjliggör enkel genom redigering snabb konstruktion av kvalitativa eller kvantitativa reporter system genom att utnyttja isogena stammar som endast skiljer sig åt på en specifik p53-RE för att undersöka sekvensspecificitet hos p53-beroende transaktivering. Å andra sidan tillåter tillgängligheten av reglerade system för utomkvedshavandeskap p53-uttryck utvärderingen av transaktivering i ett brett spektrum av proteinuttryck. Granskas i denna rapport är i stor utsträckning används system som bygger på färg reporter gener, luciferase, och tillväxten av jäst för att illustrera deras viktigaste metodologiska steg och att kritiskt bedöma deras prediktiva effekt. Dessutom kan den extrema mångsidigheten hos dessa metoder lätt utnyttjas för att studera olika TFs inklusive p63 och P73, som är andra medlemmar i TP53 Gene familj.

Introduction

Transkription är en mycket komplicerad process som involverar dynamisk, rumslig och tidsmässig organisering av transkriptionsfaktorer (TFs) och kofaktorer för rekrytering och modulering av RNA-polymeraser på kromatinregioner som svar på specifika stimuli¹ . De flesta TFs, inklusive den humana p53-tumörsuppressor, känner igen specifika CIS-verkande element i form av DNA-sekvenser som kallas responselement (REs), som består av enstaka (eller flera) unika motiv ~ 6-10 nukleotider långa. Inom dessa motiv kan individuella positioner Visa olika grader av variabilitet², vanligen sammanfattade efter positions vikts matriser (PWM) eller logotyper^3,4.

Jästen S. cerevisiae är ett lämpligt modellsystem för att studera olika aspekter av mänskliga proteiner genom komplessionstester, ektopisk uttryck och funktionella analyser, även när en ortolog jästgen inte är närvarande^{5, 6 , 7}. på grund av det evolutionära bevarandet av basala komponenter i transkriptionella systemet⁸, många mänskliga TFS (när ectopically uttrycks i jästceller) kan modulera uttrycket av en reporter gen genom att agera genom initiativtagare konstruerade för att innehåller lämpliga förnybara energikällor. Den transkription modellsystem som presenteras här för humant p53 kännetecknas av tre stora variabler vars effekter kan moduleras: 1) den modalitet uttryck och typ av p53, 2) den RE sekvens kontrollera p53-beroende transkription, och 3) vilken typ av reporter-genen (figur 1a).

När det gäller p53-uttryckets modalitet tillåter S. cerevisiae valet av inducerbara, repressibla eller konstitutiva initiativtagare^9,10,11. I synnerhet tillåter den inducerbara GAL1 promotorn basal (med raffinos som kolkälla) eller variabel (genom att ändra mängden galaktos i Media) uttryck för en TF i jäst. I själva verket representerar det fint avstämda uttrycket en kritisk utveckling för att studera inte bara p53 självt utan även andra p53-familjproteiner^12,13.

När det gäller den typ av förnybara energikällor som styr det p53-beroende uttrycket gör S. cerevisiae det möjligt att bygga olika reporter stammar som har unika skillnader i intresse för en annars ISOGEN bakgrund. Detta mål nås med hjälp av en anpassning av en särskilt mångsidig genom redigering metod som utvecklats i S. cerevisiae, kallad delitto Perfetto^12,14,15,16.

Dessutom kan olika rapportörer (dvs. URA3, HIS3 och ADE2) användas för att kvalitativt och kvantitativt utvärdera transkriptionella aktiviteter av humant TFS i S. cerevisiae, var och en med specifika funktioner som kan skräddarsys efter experimentella behov^{17,18,19,20,21}. Uttrycket av dessa rapportgener ger uracil, histidin, och adenin prototrophy, respektive. Den URA3 reporter tillåter inte tillväxten av celler i närvaro av 5-FOA också, och därmed kan det motväljas. Den ADE2 reporter systemet har fördelen att, förutom näringsmässiga urval, det gör det möjligt att identifiera jästceller som uttrycker vildtyp (dvs funktionella på ADE2 uttryck) eller mutant (dvsinte funktionella på ADE2 ) P53 från kolonens färg.

Till exempel, jästceller uttrycker ADE2 genen generera normalt stora vita kolonier på plattor som innehåller begränsande mängder av adenin (2.5-5.0 mg/L), medan de som dåligt eller inte transkribera det visas på samma platta som mindre röd (eller rosa) Kolonier. Detta beror på ackumulering av en intermediär i adenin biosyntetiska väg (dvs, P-ribosylamino-Imidazol, som tidigare har kallats amino-Imidazol ribotid eller luft), som omvandlas till ett rött pigment. Den kvalitativa färgbaserade ADE2 reporter genen har sedan ersatts med den kvantitativa Firefly Photinus mottfjärilar (LUC1)^12,22. På senare tid har ADE2 reporter kombinerats med lacz reporter i en lätt-till-poäng, semi-kvantitativ, dubbel reporter test som kan utnyttjas för att underklassificera p53 mutanter enligt deras kvarvarande nivå av funktionalitet ²³.

Fluorescerande reportrar som egfp (Enhanced Green fluorescerande protein) eller dsred (discosoma SP. Red fluorescerande protein) har också använts för kvantitativ utvärdering av transaktiveringsaktivitet förknippad med alla möjliga genom-mutationer i TP53 kodning sekvens²⁴. Slutligen har möjligheten att kombinera avstämbara promotorer för p53-allel-uttryck med isogena jäststammar som skiljer sig för re-och/eller reporter-genen lett till utvecklingen av en datamatris som genererar en förfinad klassificering av cancerrelaterad och köns Cells muterade p53-alleler^25,26,27.

De metoder som beskrivs ovan används för att mäta den transkriptionella aktiviteten hos proteinet p53. Emellertid kan uttrycket av vildtyp p53 i jästen S. cerevisiae²⁸ och Schizosaccharomyces pombe²⁹ orsaka tillväxthämning, som har förknippats med cellcykelarrest^28,30 eller celldöd³¹. I båda fallen utlöses jästtillväxthämning av högt p53-uttryck och har korrelerats med potentiell transkriptionell modulering av endogena jästgener involverade i celltillväxt. Genom att stödja denna hypotes har förlusten av funktion Mutant p53 R273H inte interfererat med jästcellernas tillväxt när den uttrycks på liknande nivåer som vildtyp p53³². Omvänt orsakade uttrycket i jäst av det giftiga muterade p53 V122A (känt för högre transkriptionell aktivitet jämfört med vildtyp p53) en starkare tillväxthämmande effekt än av vildtyp p53³².

Dessutom visades att Human MDM2 kunde hämma den humana p53-transkriptionella aktiviteten i jäst, främja dess ubiquitination och efterföljande nedbrytning³³. Följaktligen visades förmågan hos Human MDM2 och mdmx att hämma p53-inducerad jäst tillväxthämning^32,34. I en ytterligare studie fastställdes ett samband mellan p53-transskriptionell aktivitet och aktin-uttrycksnivåer, med identifieringen av ett förmodat p53-medel uppströms på ÄRV1 -genen i jäst³². Konsekvent, aktin uttryck förstärktes av vildtyp p53 och ännu mer av p53 V122A, men inte av muterat p53 R273H. Omvänt minskade aktin-uttrycket av p53 i samtidig förekomst av p53-hämmare MDM2, mdmx eller pifithrin-α (en liten molekyl hämmare av p53-transkriptionell aktivitet), som överensstämde med resultat baserade på jästtillväxtanalysen. Viktigt, dessa resultat fastställde ett samband mellan p53-inducerad tillväxthämning och graden av dess aktivitet i jäst, som också har utnyttjats för att identifiera och studera små molekyler som modulerar p53-funktioner^{28,34 , 35}.

Protocol

1. uppförande av ADE2 eller LUC1 reporter jäststammar som innehåller en specifik re (yafm-re eller ylfm-re) Strimma en yafm-iCore eller ylfm-iCore stam12,14 (iCore = I, ISCE-I endonuclease under GAL1 promotor; CO = räknare valbar URA3; RE = reporter KanMX4 Förlänande kanamycin motstånd; Tabell 1) från en 15% glycerolstock lagrad vid-80 ° c på en YPDA-agar-platta (tabell 2</s…

Representative Results

Byggandet av ADE2 or LUC1 reporter jäststammar Dendelitto perfettoapproach12,14,15,16 har anpassats för att möjliggöra byggandet av p53 reporter jäststammar (figur 1…

Discussion

Jästbaserade analyser har visat sig vara användbara för att undersöka olika aspekter av p53-proteinfunktioner. Dessa analyser är särskilt känsliga för utvärdering av p53-transaktiveringspotential mot varianter av RE-målplatser, inklusive utvärdering av funktionella polymorfismer. Användningen av färg reportrar samt miniatyrisering av luciferas-analysen resulterar i kostnadseffektiva och relativt skalbara analyser. Dessutom är tillväxthämmande test potentiellt mottagliga för att användas i kemisk bibliot…

Materials

L-Aspartic acid	SIGMA	11189
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
L-Phenylalanine	SIGMA	78019
Peptone	BD Bacto	211677
Yeast ex+A2:C26tract	BD Bacto	212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate	BDTM	233520
Lithium Acetate Dihydrate	SIGMA	517992
Bacteriological Agar Type A	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 disulfate salt	SIGMA	A1720
Ammonium Sulfate	SIGMA	A2939
L-Arginine Monohydro-chloride	SIGMA	A5131
Adenine Hemisulfate Salt	SIGMA	A9126
Passive Lysis Buffer 5x	PROMEGA	E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-Galactose	SIGMA	G0750
L-Glutamic acid	SIGMA	G1251
Dextrose	SIGMA	G7021
L-Histidine	SIGMA	H8125
L-Isoleucine	SIGMA	I2752
L-Lysine	SIGMA	L1262
L-Leucine	SIGMA	L8000
L-Methionine	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate	SIGMA	R0250
L-Serine	SIGMA	S4500
L-Tryptophan	SIGMA	T0271
L-Threonine	SIGMA	T8625
Uracil	SIGMA	U0750
L-Valine	SIGMA	V0500