Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano
Summary
Descriviamo gli approcci per la manipolazione dei geni nel sistema modello evolutivo Astyanax mexicanus. Sono descritti tre diverse tecniche: transgenesi Tol2-mediata, mirata manipolazione del genoma utilizzando CRISPR/Cas9 e atterramento di espressione utilizzando morpholinos. Questi strumenti dovrebbero facilitare l’indagine diretta di geni alla base della variazione tra forme di superficie e caverne.
Abstract
Grotta di animali forniscono un sistema convincente per indagare i meccanismi evolutivi e le basi genetiche alla base di cambiamenti in numerosi tratti complessi, tra cui la degenerazione degli occhi, albinismo, perdita di sonno, iperfagia ed elaborazione sensoriale. Specie di caverna da tutto il mondo visualizzare un’evoluzione convergente dei tratti morfologici e comportamentali a causa di pressioni ambientali condivisi tra sistemi differenti della caverna. Grotta diverse specie sono state studiate nell’impostazione del laboratorio. Il tetra messicano, Astyanax mexicanus, con forme di ipovedenti e non vedenti, ha fornito le comprensioni uniche nei processi biologici e molecolari che sono alla base dell’evoluzione dei tratti complessi ed è ben studiato come sistema modello emergenti. Mentre in a. mexicanus, sono stati identificati geni che regolano l’evoluzione di diversi processi biologici, la possibilità di convalidare un ruolo per singoli geni è stata limitata. L’applicazione della transgenesi e modifica del gene tecnologia ha il potenziale per superare questo ostacolo significativo e per studiare i meccanismi alla base dell’evoluzione dei tratti complessi. Qui, descriviamo una metodologia diversa per la manipolazione di espressione genica in a. mexicanus. Approcci includono l’uso di morpholinos, Tol2 transgenesi, e modelli di sistemi gene-editing, comunemente utilizzati in zebrafish e altri pesci di funzione del gene in a. mexicanusdi manipolare. Questi protocolli includono le descrizioni dettagliate delle procedure di allevamento temporizzata, la raccolta di uova fecondate, iniezioni e la selezione di animali geneticamente modificati. Questi approcci metodologici permetterà per l’indagine dei meccanismi genetici e neurali che l’evoluzione dei diversi tratti in a. mexicanus.
Introduction
Da allora di Origine delle speciedi Darwin1, gli scienziati hanno acquisito profonde intuizioni come tratti sono modellati evolutivamente in risposta a pressioni ambientali ed ecologiche definite, grazie alla grotta organismi2. Il tetra messicano, a. mexicanus, consiste di eyed popolazioni ‘superficie’ ancestrale che popolano fiumi tutto il Messico e il Texas del sud e di almeno 29 popolazioni geograficamente isolate di morph grotta derivata che abitano la Sierra del Abra e altre zone del Messico nord-orientale3. Un numero di tratti di grotta-collegati è stato identificato in a. mexicanus, compreso consumo di ossigeno alterata, depigmentazione, perdita degli occhi e alterata alimentazione e foraggiamento comportamento4,5,6, 7,8,9. A. mexicanus presenta un potente modello per studiare i meccanismi di evoluzione convergente a causa di una ben definita storia evolutiva, una dettagliata caratterizzazione dell’ambiente ecologico e la presenza di indipendentemente evoluto grotta popolazioni10,11. Molti dei tratti grotta-derivati che sono presenti nella caverna, compresa la perdita dell’occhio, perdita di sonno, alimentazione, perdita di scolarizzazione è aumentato, ridotto di aggressione e ridotto le risposte allo stress, più volte si sono evoluti attraverso origini indipendenti, spesso utilizzando diverse vie genetiche tra grotte8,12,13,14,15. Questo ripetuto evolution è un aspetto potente del sistema a. mexicanus e può fornire spaccato la questione più generale dei sistemi genetici come può essere perturbato per generare fenotipi simili.
Mentre l’applicazione della tecnologia genetica per l’indagine meccanicistica della funzione del gene è stato limitato in molte specie di pesci (tra cui a. mexicanus), gli avanzamenti recenti in zebrafish forniscono una base per lo sviluppo della tecnologia genetica nei pesci 16,17,18,19,20. Numerosi strumenti sono ampiamente utilizzati in zebrafish per manipolare l’espressione genica e l’attuazione di queste procedure a lungo sono stati standardizzati. Ad esempio, l’iniezione di morpholino oligos (MOs) a livello di singola cellula selettivamente blocca RNA e impedisce la traduzione per una breve finestra temporale durante sviluppo21,22. Inoltre, modifica del gene approcci, come cluster regolarmente intervallate brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR-collegato della proteina 9 (Cas9) e nucleasi di trascrizione attivatore-come effettore (TALEN), consentire per la generazione delle omissioni definite o, in alcuni casi, gli inserimenti attraverso una ricombinazione in genomi19,20,23,24. Transgenesi sono utilizzata per modificare l’espressione genica stabile o funzione in un modo specifico di cellula-tipo. Il sistema Tol2 viene utilizzato efficacemente per generare animali transgenici di pre transposase mRNA con un plasmide DNA Tol2 contenente un transgene25,26. Il sistema Tol2 utilizza la transposase Tol2 di medaka per generare gli inserimenti di germline stabile di transgenici construct17. Generazione di Tol2 transgenetica coinvolge pre un plasmide contenente un transgene affiancato da siti di integrazione Tol2 e mRNA per Tol2 transposase17. Questo sistema è stato utilizzato per generare una matrice di linee transgeniche in zebrafish e il suo utilizzo ha recentemente ampliato ai sistemi modello emergente addizionali, tra cui ciclidi, killifish, spinarello e, più recentemente, la caverna messicano27, 28,29,30.
Mentre la caverna è un affascinante sistema biologico per meccanismi di comprensione dell’evoluzione del tratto, sua piena capacità come un modello evolutivo non è stata pienamente sfruttata. Ciò è parzialmente dovuto un’incapacità di manipolazione genetica e cellulare direttamente funzionare31. Geni candidati tratti complessi di regolazione sono stati identificati usando quantitative trait loci (QTL) gli studi, ma la convalida di questi geni candidati è stato difficile32,33,34. Recentemente, transitoria atterramento utilizzando morpholinos, gene editing utilizzando sistemi CRISPR e TALEN e l’uso di Tol2-transgenesi mediate sono stati usati per studiare le basi genetiche alla base di un numero di tratti35,36,37 ,38. L’implementazione e la standardizzazione di queste tecniche vi permetterà per le manipolazioni che interrogano le basi molecolari e neurali di tratti biologici, tra cui la manipolazione della funzione genica, l’etichettatura delle popolazioni di cellule definito, e l’espressione dei reporter funzionale. Considerando che l’efficace attuazione di questi strumenti genetici per manipolare gene o funzione cellulare è stata dimostrata in sistemi modello emergente, protocolli dettagliati sono ancora carenti in a. mexicanus.
A. mexicanus forniscono approfondimenti critici i meccanismi dell’evoluzione in risposta ai cambiamenti ambientali e presentare l’opportunità di identificare nuovi geni che regolano diversi tratti. Una serie di fattori suggeriscono che a. mexicanus è un modello estremamente trattabile per l’applicazione degli strumenti genomici stabiliti attualmente disponibile in modelli genetici consolidati, tra cui la possibilità di mantenere facilmente il pesce nei laboratori di grandi dimensioni di covata, trasparenza, un genoma sequenziato e analisi comportamentali definiti39. Qui, descriviamo una metodologia per l’uso di morpholinos, transgenesi e gene editing in superficie e Grotta di popolazioni di a. mexicanus. La più ampia applicazione di questi strumenti in a. mexicanus consentirà un’indagine meccanicistica di processi molecolari che sono alla base dell’evoluzione delle differenze inerenti allo sviluppo, fisiologiche e comportamentali tra caverna e pesci di superficie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo fornito una metodologia per la manipolazione di funzione del gene usando morpholinos, CRISPR/Cas9 gene editing e metodologia di transgenesi. La ricchezza della tecnologia genetica e l’ottimizzazione di questi sistemi in zebrafish consentirà probabilmente per il trasferimento di questi strumenti a. mexicanus con facilità52. Recenti scoperte hanno utilizzato questi approcci in a. mexicanus, ma rimangono sottoutilizzate nell’indagine su diversi tratti morfologici, del…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Sunishka Thakur per la sua assistenza in genotipizzazione e imaging il pesce mutante oca2 rappresentato nella Figura 2. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) award 1656574 a A.C.K, NSF award 1754321 J.K. e A.C.K e premio National Institutes of Health (NIH) R21NS105071 a A.C.K ed E.R.D.
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
Riferimenti
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