מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני
Summary
אנו מתארים גישות על המניפולציה של גנים במערכת המודל האבולוציוני Astyanax mexicanus. שלוש טכניקות שונות מתוארים: בתיווך Tol2 transgenesis, יישוב מניפולציה של הגנום באמצעות CRISPR/Cas9, ואת נוקאאוט של הביטוי תוך שימוש morpholinos. כלים אלה צריך לאפשר חקירה ישירה של גנים שבבסיס וריאציית בין פני השטח – ואת מערת המגורים טפסים.
Abstract
מערת חיות מספקים מערכת משכנעת על חקירת מנגנונים אבולוציונים ובסיסים הגנטי שבבסיס לשינויים רבים תכונות מורכבות, לרבות ניוון העין, לבקנות, אובדן שינה, hyperphagia, והעיבוד החושי. מינים של cavefish מ ברחבי העולם להציג של אבולוציה מתכנסת של מאפיינים מורפולוגיים והתנהגותיים עקב לחצים סביבתיים משותפים בין מערכות שונות מערה. מערת מגוונת מיני נחקרו בהגדרת מעבדה. טטרה מקסיקנית, Astyanax mexicanus, עם צורות רואי ועיוורת, סיפקה ייחודי תובנות ותהליכי הביולוגי המולקולרי שבבסיס האבולוציה של תכונות מורכבות, שאיזו היטב כמערכת מודל המתעוררים. בעוד גנים המועמד ויסות ההתפתחות של תהליכים ביולוגיים שונים זוהו mexicanus א, היכולת לאמת תפקיד עבור גנים יחידניים הוגבלה. היישום של transgenesis וטכנולוגיה לעריכת ג’ין יש פוטנציאל כדי להתגבר על מכשול משמעותי הזה וכדי לחקור את המנגנונים האבולוציה של תכונות מורכבות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה שונים מניפולציות ביטוי גנים ב- mexicanus א. גישות כוללים את השימוש morpholinos, Tol2 transgenesis, מערכות עריכה-ג’ין, בדרך כלל בשימוש דג זברה ודגים אחרים מודלים, לתמרן פונקצית ג’ין mexicanus א. פרוטוקולים אלה כוללים תיאורים מפורטים של תהליכי הרבייה מתוזמן, איסוף הביצים, זריקות, הבחירה של בעלי חיים מהונדסים. אלה גישות מתודולוגיים יאפשר לחקירת גנטי והעצבים המנגנונים האבולוציה של תכונות מגוונות ב- mexicanus א.
Introduction
מאז מוצא המיניםשל דרווין1, מדענים זכו תובנות עמוקות כמה תכונות הם בצורת אבולוציונית בתגובה מוגדר לחצים סביבתית ואקולוגית, בזכות מערת אורגניזמים2. טטרה מקסיקנית, mexicanus א, מורכב של אוכלוסיות ‘משטח’ אב קדמון eyed המאכלסים נהרות ברחבי מקסיקו בדרום טקסס ושל אוכלוסיות מבודדת מבחינה גיאוגרפית לפחות 29 של מערת נגזר morphs המאכלסים את אברה דל סיירה, באזורים אחרים של צפון-מזרח מקסיקו3. מספר תכונות הקשורות מערת זוהו mexicanus א, כולל צריכת החמצן מסולף, depigmentation, אובדן של העיניים, ושינינו האכלה, שיחור מזון התנהגות4,5,6, 7,8,9. מתנות mexicanus א במודל רב עוצמה עבור חוקרים מנגנונים של אבולוציה מתכנסת היסטוריה אבולוציונית מוגדרים היטב, אפיון מפורט של הסביבה האקולוגית וכתוצאה הנוכחות באופן עצמאי התפתחו המערה אוכלוסיות10,11. רבים מן התכונות הנגזרות למערה נמצאים ב- cavefish, כולל אובדן עינו, לישון אובדן, גדל האכלה, אובדן של בתי הספר, להפחית תוקפנות, ו מופחתת תגובות הלחץ, התפתחו מספר פעמים דרך מקורות עצמאיים, לעיתים קרובות ניצול מסלולים גנטיים שונים בין מערות8,12,13,14,15. זה חוזר על עצמו האבולוציה הוא היבט רב עוצמה של מערכת mexicanus א , מספקים תובנה השאלה כללית יותר של מערכות איך גנטי עשוי להיות מוטרד כדי להפיק דומה פנוטיפים.
בעת היישום של טכנולוגיה גנטיים מכניסטית חקירת פונקציה ג’ין הגביל ב מיני דגים רבים (כולל mexicanus א), התפתחויות אחרונות דג זברה לספק בסיס לפיתוח טכנולוגיה גנטיות דגים 16,17,18,19,20. כלים רבים נמצאים בשימוש נרחב דג זברה לתמרן ביטוי גנים, היישום של נהלים אלה זמן סטנדרטית. לדוגמה, ההזרקה של מורפולינו oligos (MOs) בשלב תא בודד באופן סלקטיבי חוסם RNA ומונעת תרגום עבור חלון זמן קצר במהלך פיתוח21,22. בנוסף, עריכת ג’ין גישות, כגון מקובצים באופן קבוע interspaced חזרה palindromic קצר (CRISPR) / CRISPR-הקשורים חלבון 9 (Cas9) ותמלול activator דמוי אפקטור נוקלאז (TALEN), לאפשר לדור של מחיקות מוגדר או, במקרים מסוימים, הוספות דרך רקומבינציה הגנום19,20,23,24. Transgenesis משמש כדי לתפעל ביטוי גנים יציב או הפונקציה באופן ספציפי סוג התא. מערכת Tol2 משמש ביעילות כדי ליצור חיות הטרנסגניים מאת coinjecting transposase mRNA עם פלסמיד ה-DNA Tol2 המכילה25,transgene26. מערכת Tol2 מנצל את transposase Tol2 של medaka כדי להפיק germline יציב הוספות של construct17 הטרנסגניים. יצירת Tol2 transgenics כרוך coinjecting של פלסמיד המכיל transgene ולצדו Tol2 ואתרי אינטגרציה mRNA Tol2 transposase17. מערכת זו שימש לייצר מגוון של קווים הטרנסגניים דג זברה ואת השימוש בה התרחב לאחרונה מערכות מודל מתהווים נוספים, כולל cichlids, דגים גמבוזיים, את stickleback, ו, לאחרונה, cavefish מקסיקני27, 28,29,30.
ואילו cavefish היא מערכת ביולוגית מרתק שחקרתי מנגנוני האבולוציה תכונה, יכולת מלאה שלה כמודל אבולוציונית לא היה מלא רתם. זה כבר חלקית בשל חוסר יכולת לתמרן גנטי, הסלולר יפעלו ישירות31. גנים המועמד ויסות תכונות מורכבות זוהו באמצעות תכונה כמותית אתרים כמותיים מחקרים, אך האימות של גנים אלו המועמד היה קשה32,33,34. לאחרונה, נוקאאוט ארעי באמצעות morpholinos, ג’ין עריכה באמצעות מערכות CRISPR ו- TALEN, ואת השימוש Tol2-transgenesis בתיווך שימשו כדי לחקור את הבסיס הגנטי שבבסיס מספר תכונות35,36,37 ,38. יישום והטמעה סטנדרטיזציה של טכניקות אלה יאפשר מניפולציות זה לחקור את הפסיכולוגי עצבית המולקולריים של תכונות ביולוגיות, כולל המניפולציה של תפקוד הגן, תיוג של אוכלוסיות תאים מוגדרים, ו הביטוי של עיתונאים פונקציונלי. ואילו יישום מוצלח של כלים גנטיים אלה לתמרן גן או תפקוד התאים הוכח במערכות דגם מתהווה, פרוטוקולים מפורט עדיין חסרים mexicanus א.
Mexicanus א לספק תובנות מנגנוני האבולוציה בתגובה לסביבה המשתנה הקריטי ולהציג את ההזדמנות כדי לזהות גנים הרומן ויסות תכונות מגוונות. מספר גורמים מראים כי mexicanus א הוא מודל מאוד צייתן להחלת הוקמה גנומית כלי זמין כרגע ויצר מודלים גנטי, כולל את היכולת בקלות לשמור על הדגים במעבדות, גודל שבוחרים גדול, שקיפות, הגנום ברצף וכן מבחני התנהגות מוגדרים39. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לשימוש של morpholinos, transgenesis, ג’ין ועריכה של אוכלוסיית השטח ומערת של mexicanus א. היישום רחבה יותר של כלים אלה ב- mexicanus א יאפשר חקירה מכניסטית התהליכים המולקולרי שבבסיס האבולוציה של הבדלים התפתחותיים, פיזיולוגיים והתנהגותיים בין cavefish לבין משטח דגים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנחנו מסופקים מתודולוגיה מניפולציה ג’ין פונקציה באמצעות morpholinos, CRISPR/Cas9 ג’ין עריכה מתודולוגיה transgenesis. העושר של טכנולוגיה גנטית ואופטימיזציה של מערכות אלה דג זברה סביר יאפשר העברת מכלים אלה לתוך mexicanus א עם נוחות52. הממצאים האחרונים השתמשו גישות אלה ב- mexicanus א, אך הם נ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים Sunishka טהאקור על לה סיוע genotyping והדמיה הדג מוטציה oca2 מתואר באיור2. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית (NSF) פרס 1656574 A.C.K. פרס ה-NSF 1754321 J.K., A.C.K., פרס לאומי מכונים לבריאות (NIH) R21NS105071 A.C.K., E.R.D.
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
References
- Darwin, C. . On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , (1859).
- Culver, D. C., Pipan, T. . The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , (2009).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
- Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
- Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Yoshizawa, M., Gorički, &. #. 3. 5. 2. ;., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
- Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
- Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
- Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
- Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
- Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
- Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
- Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
- Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
- Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
- Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
- Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
- Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
- Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
- Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
- Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
- Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).
