멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작
Summary
진화 모델 시스템 Astyanax mexicanus유전자의 조작 방법을 설명합니다. 세 가지 다른 기술 설명: 중재 하는 Tol2 transgenesis, CRISPR/Cas9, 및 morpholinos를 사용 하 여 식의 최저 사용 하 여 게놈의 타겟된 조작. 이 도구는 기본 표면 및 동굴 주거 형태 사이의 변형 유전자의 직접 조사를 용이 해야.
Abstract
동굴 동물 진화 메커니즘 및 기본 변경 눈 변성, 獸, 수 면 감소, hyperphagia, 및 감각 처리를 포함 하 여 수많은 복잡 한 특색에 유전 기초 조사를 위한 경쟁력 있는 시스템을 제공 합니다. 세계 각국에서 cavefish의 종 다른 동굴 시스템 간의 공유 환경 압력 때문에 형태학과 행동 특성의 수렴 진화를 표시합니다. 다양 한 동굴 종 실험실 조정에서 공부 되었습니다 했다. 시력, 눈 먼 형태와 멕시코 tetra Astyanax mexicanus, 밑에 복잡 한 특성의 진화 생물학과 분자 프로세스에 대 한 독특한 통찰력을 제공 하고있다 그리고 신흥 모델 시스템으로 잘 태세입니다. 다양 한 생물 학적 과정의 진화를 규제 하는 후보 유전자 A. mexicanus에 확인 되었습니다, 하는 동안 개별 유전자에 대 한 역할의 유효성을 검사 하는 기능 제한 되었습니다. Transgenesis 및 유전자 편집 기술을의 적용이 중요 한 장애를 극복 하 고 복잡 한 특성의 진화를 기본 메커니즘을 조사 가능성이 있다. 여기, A. mexicanus에서 유전자 발현을 조작 하기 위한 다른 방법을 설명 합니다. Morpholinos, Tol2 transgenesis의 사용을 포함 하는 접근 하 고 유전자 편집 시스템, 제 브라에서 일반적으로 사용 되 고 다른 물고기 모형, A. mexicanus에서 유전자 기능을 조작 하. 이러한 프로토콜 초과 사육 절차에 대 한 자세한 설명, 수정 된 계란, 주사, 그리고 유전자 변형된 동물의 선택의 컬렉션을 포함합니다. 이 방법론 접근 A. mexicanus에서 다양 한 특성의 진화를 기본 유전과 신경 메커니즘의 조사에 대 한 수 있습니다.
Introduction
다윈의 종의 기원1, 이후 과학자 들은 어떻게 특성 정의 된 환경 및 생태 압력, 동굴 생물2덕분에 진화론 모양에 대 한 깊은 통찰력을 얻고 있다. 멕시코 tetra, A. mexicanus, 강 멕시코와 남부 텍사스 살고 눈된 조상 ‘표면’ 인구와 파생된 동굴 변경해 거주 시에라 델 Abra의 적어도 29 지리적으로 고립 된 인구 구성 및 북동 멕시코3의 다른 지역입니다. A. mexicanus, 바꾸 인된 산소 소비, depigmentation, 눈를 포함 하 여 그리고 유와 구하고 행동4,,56, 변경에 확인 된 동굴 관련 된 특성의 수 7,,89. A. mexicanus 선물 잘 정의 된 진화 역사, 생태 환경, 상세한 특성화 및의 존재로 인해 수렴 진화의 메커니즘을 독립적으로 조사를 위한 강력한 모델 진화 동굴 인구10,11. 많은 눈의 손실을 포함 한 cavefish에, 손실 자, 먹이, 훈련의 손실 증가, 침략, 및 스트레스 응답을 감소, 감소 독립 기원, 자주 활용을 통해 여러 번 진화 하는 동굴에서 파생 된 특성은 다른 유전 통로 사이 동굴8,12,13,,1415. 이 반복은 A. mexicanus 시스템의 강력한 측면 이다 진화와 비슷한 고기를 생성 하 어떻게 유전자 시스템의 보다 일반적인 질문에 대 한 통찰력을 불안정 수 있습니다 제공할 수 있습니다.
유전자 기능의 기계 조사에 대 한 유전자 기술의 응용 ( A. mexicanus를 포함 하 여) 많은 물고기 종에 제한 되어는 제 브라의 최근 발전 제공 기준 물고기에서 유전자 기술 개발 16,17,18,19,20. 수많은 도구는에서 널리 이용 되 zebrafish 유전자 발현, 조작 하 고 이러한 절차의 구현 표준화 오래 있다. 예를 들어 단일 셀 단계에서 morpholino oligos (MOs)의 주입은 선택적으로 RNA를 차단 하 고 개발21,22동안 간단한 임시 창에 대 한 번역을 방지. 또한, 유전자 편집 방법, 정기적으로 클러스터 된 같이 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) / CRISPR-관련 단백질 9 (Cas9) 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nuclease (TALEN), 정의 된 삭제의 세대에 대 한 허용 또는, 경우에 따라 게놈19,20,,2324에서 재결합을 통해 삽입. Transgenesis 셀 형식을 특정 방식으로 안정적인 유전자 발현 또는 기능을 조작 하는 데 사용 됩니다. Tol2 시스템은 transposase coinjecting에 의해 유전자 변형 동물을 생성 하기 위해 효과적으로 사용 transgene25,26를 포함 하는 Tol2 DNA 플라스 미드와 mRNA. Tol2 시스템 생성 유전자 변형 construct17의 안정적인 생식 삽입 하 메 다카의 Tol2 transposase를 사용 합니다. Tol2 제 닉 생성 coinjecting Tol2 transposase17 Tol2 통합 사이트 및 mRNA에 의해 형벌 transgene를 포함 하는 플라스 미드 포함 됩니다. 이 시스템 zebrafish에 유전자 변형 라인의 배열을 생성 하는 데 사용 되었습니다 및 사용 시 클 리드, 송사리, stickleback를 포함 하 여 추가 긴급 모델 시스템을 최근 확장 했다 그리고, 최근에, 멕시코 cavefish27, 28,29,30.
cavefish 특성이 진화의 elucidating 메커니즘에 대 한 매혹적인 생물 학적 시스템은, 진화 모델로 서의 전체 능력은 하지 되었습니다 완전히 무력화. 이것은 부분적으로 유전자를 조작 하는 무 능력 때문 이었고 휴대 기능 직접31. 양적 특성 loci (QTL) 연구를 사용 하 여 복잡 한 특성을 조절 하는 후보 유전자 확인 되었습니다 하지만이 후보 유전자의 유효성 검사는 어려운32,33,34되었습니다. 최근, morpholinos, CRISPR 및 TALEN 시스템 및 Tol2를 사용 하 여를 사용 하 여 편집 하는 유전자를 사용 하 여 일시적인 최저-중재 transgenesis 유전으로 기본 특성35,36,37의 수를 조사 하는 데 사용 되었습니다 ,38. 구현 및 이러한 기술의 표준화의 생물 학적 특성, 유전자 기능, 정의 된 세포 인구의 라벨의 조작을 포함 한 분자 및 신경 토대를 심문 하는 조작에 대 한 수 고 식 기능 기자입니다. 반면 유전자 또는 세포 기능 하 유전 이러한 도구를 성공적으로 구현 응급 모델 시스템에서 입증 되었습니다, 상세한 프로토콜은 여전히 A. mexicanus부족.
A. mexicanus 변화 하는 환경에 대 한 응답에서 진화의 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 하 고 다양 한 특성을 조절 하는 새로운 유전자를 식별 하는 기회. 요인의 수는 A. mexicanus 는 쉽게 큰 무리 크기는 실험실에서 물고기를 유지 하는 기능을 포함 하 여 설립된 유전자 모델에서 현재 사용할 수 있는 설립된 게놈 도구를 적용 하기 위한 매우 온순한 모델 제안 투명성, 시퀀스 된 게놈 및 정의 된 행동 분석39. 여기, 우리는 morpholinos, transgenesis, A. mexicanus의 표면 및 동굴 인구에서 유전자 편집의 사용에 대 한 방법론을 설명 합니다. A. mexicanus 에서 이러한 도구의 광범위 한 응용 프로그램의 발달, 생리, 및 행동 차이 cavefish 및 표면 물고기의 진화를 기본 분자 과정에 기계 조사에 대 한 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 morpholinos, CRISPR/Cas9 유전자 편집, transgenesis 방법론을 사용 하 여 유전자 기능을 조작 하기 위한 방법론을 제공 합니다. 유전자 기술의 부와 제 브라에서 이러한 시스템의 최적화 이러한 도구를 쉽게52와 A. mexicanus 에 이전 하면 가능성이 있습니다. 최근 연구 결과 A. mexicanus를 이러한 방식을 사용 하지만 그들은이 시스템30,,</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 유전형에 oca2 돌연변이 물고기 그림2 이미징 그녀의 지원에 대 한 Sunishka Thakur 감사 합니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (NSF) 수상 1656574 A.C.K., NSF 상을 조 앤을 A.C.K., 1754321 및 국립 보건원 (NIH) 수상 R21NS105071 A.C.K. 및 E.R.D.에 의해 지원 되었다
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
Riferimenti
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