JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Genetics

Manipulering av gen funksjon i meksikansk Cavefish

Published: April 22, 2019
doi:
10.3791/59093
, , , , ,
1Department of Biological Sciences,Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative,Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College,Florida Atlantic University

Summary

Vi beskriver metoder for manipulering av gener i den evolusjonære modellsystem Astyanax mexicanus. Tre ulike teknikker er beskrevet: Tol2-mediert transgenesis, målrettet manipulering av genomet bruker CRISPR/Cas9 og knockdown uttrykk ved hjelp av morpholinos. Disse verktøyene skal lette direkte etterforskning av gener underliggende variasjon mellom overflaten og hulen boligen skjemaer.

Abstract

Hulen dyr gir et spennende system for gransker evolusjonære mekanismer og genetisk baser underliggende endringer i mange komplekse egenskaper, inkludert øye degenerasjon, albinisme, sove tap, hyperphagia og sensorisk prosessering. Arter av cavefish fra hele verden vise en konvergent evolusjon av morfologiske og atferdsmessige egenskaper på grunn av delt miljøbelastningene mellom forskjellige hule systemene. Mangfoldig hule arter har blitt studert i laboratoriet innstillingen. Den meksikanske tetra, Astyanax mexicanus, med seende og blind skjemaer har unik innsikt i biologiske og molekylære prosesser underliggende utviklingen av komplekse trekk og er godt klar som en ny modell. Mens kandidat gener regulere utviklingen av ulike biologiske prosesser er blitt identifisert i A. mexicanus, er muligheten til å validere en rolle for enkelte gener begrenset. Programmet transgenesis og gen-redigering teknologi har potensialet å overvinne denne betydelig hinder og undersøke mekanismene bak utviklingen av komplekse trekk. Her beskriver vi en annen metode for å manipulere genuttrykk i A. mexicanus. Metoder omfatter bruk av morpholinos, Tol2 transgenesis, og gen-redigering systemer, vanligvis brukes i sebrafisk og andre fisk modeller, manipulere gen funksjon i A. mexicanus. Disse protokollene inneholder detaljerte beskrivelser av tidsbestemte avl prosedyrer, innsamling av befruktet egg, injeksjoner og valg av genmodifiserte dyr. Disse metodologiske tilnærmingsmåter vil tillate etterforskningen av genetiske og nevrale mekanismene bak utviklingen av forskjellige trekk i A. mexicanus.

Introduction

Siden Darwins Origin of Species1fått forskere betydelig innsikt i hvordan trekk er formet evolusjonært svar på definerte miljøeffekter og økologiske press, takket være hule organismer2. Den meksikanske tetra, A. mexicanus, består av eyed forfedrenes ‘overflate’ populasjoner som bor elver i Mexico og sørlige Texas og minst 29 geografisk isolert bestander av avledede hule morphs bor Sierra del Abra og andre deler av nordøst Mexico3. En rekke hule-tilknyttede egenskaper har blitt identifisert i A. mexicanus, inkludert endrede oksygenforbruk, depigmentering, tap av øyne, og endret fôring og beite atferd4,5,6, 7,8,9. A. mexicanus presenterer en kraftig modell for å undersøke mekanismer for konvergent evolusjon en veldefinert evolusjonær historie, en detaljert karakterisering av økologiske miljøet og tilstedeværelsen av uavhengig utviklet seg hulen bestander10,11. Mange av de avledede hule egenskapene som finnes i cavefish, inkludert øye tap, sove tap, økt fôring, tap av skolegang, redusert aggresjon, og redusert stressresponser, har utviklet seg flere ganger gjennom uavhengige opprinnelse, ofte utnytte ulike genetisk veier mellom grotter8,12,13,14,15. Dette gjentas evolusjon er en kraftig del av A. mexicanus og kan gi innsikt i spørsmålet om hvordan genetiske systemer mer generelle kan være opprørt generere lignende fenotyper.

Mens anvendelsen av genetisk teknologi for mekanistisk etterforskningen av gen funksjon har blitt begrenset mange fiskearter (inkludert A. mexicanus), gir nylige fremskritt innen sebrafisk grunnlag for genetisk teknologiutvikling i fisk 16,17,18,19,20. Mange verktøy er mye brukt i sebrafisk for å manipulere genekspresjon, og gjennomføringen av disse prosedyrene har lenge blitt standardisert. For eksempel injeksjon av morpholino oligos (MOs) på encellede scenen selektivt blokkerer RNA og hindrer oversettelse for et kort timelige vindu under utvikling21,22. I tillegg gen-redigering tilnærminger, slik som clustered regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) / CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) og transkripsjon aktivator som effektor nuclease (TALEN), tillater generering av definerte slettinger eller, i noen tilfeller, innsettinger gjennom en rekombinasjon i genomer19,20,23,24. Transgenesis brukes til å manipulere stabil genuttrykk eller funksjonen på en celle-type bestemt måte. Tol2 systemet brukes effektivt til å generere transgene dyr ved coinjecting transposase mRNA med en Tol2 DNA plasmider inneholder en transgene25,26. Tol2 systemet benytter Tol2 transposase av medaka å generere stabil germline innsettinger av transgene construct17. Genererer Tol2 transgenics innebærer coinjecting en plasmider inneholder en transgene flankert av Tol2 integrasjon områder og mRNA for Tol2 transposase17. Dette systemet har blitt brukt til å generere en rekke transgene linjer i sebrafisk og bruken har nylig utvidet til flere emergent modellsystemer, inkludert ciklider, killifish, Stingsild, og, mer nylig, den meksikanske cavefish27, 28,29,30.

Cavefish er et fascinerende biologiske system for Klargjørende mekanismer av egenskap evolusjon, har sin fulle kapasitet som en evolusjonær modell ikke blitt fullt utnyttet. Dette er delvis på grunn av en manglende evne til å manipulere genetiske og cellular fungere direkte31. Kandidat gener regulere komplekse egenskaper har blitt identifisert ved hjelp av kvantitative egenskap loci (QTL) studier, men validering av disse kandidat gener er vanskelig32,33,34. Nylig forbigående knockdown bruker morpholinos, gene redigering med CRISPR og TALEN, og bruk av Tol2-mediert transgenesis har blitt brukt til å undersøke genetisk grunnlag underliggende flere trekk35,36,37 ,38. Implementering og standardisering av disse teknikkene gjør manipulasjoner som forhøre molekylære og nevrale grunnlaget for biologiske egenskaper, inkludert manipulering av gen funksjon, merkingen av definerte celle populasjoner, og uttrykket av funksjonelle journalister. Mens den vellykkede implementeringen av disse genetiske verktøy for å manipulere genet eller cellulære funksjoner har blitt vist i emergent modellsystemer, er detaljert protokoller fortsatt mangler i A. mexicanus.

A. mexicanus gi viktig innsikt i mekanismer for utviklingen som svar på en endring miljøet og presentere mulighet til å identifisere romanen gener som regulerer ulike egenskaper. En rekke faktorer tyder på at A. mexicanus er en ekstremt tett modell for søker etablerte genomisk verktøy tilgjengelig i etablerte genetisk modeller, inkluderer evnen å lett vedlikeholde fisk i laboratorier, stor Foreldreomsorg og yngelens størrelse, åpenhet, sekvensert genomet og definerte opptreden analyser39. Her beskriver vi en metode for bruk av morpholinos, transgenesis og gene redigere overflaten og hule bestander av A. mexicanus. Bredere anvendelse av disse verktøyene i A. mexicanus vil tillate en mekanistisk undersøkelse molekylære prosesser underliggende utviklingen av utviklingsmessige, fysiologiske og behavioral forskjellene mellom cavefish og overflate fisk.

Protocol

1. Morpholino oligo design Merk: Sekvenser for A. mexicanus er tilgjengelig gjennom nasjonale senter for bioteknologi informasjon (NCBI) Gene og NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), samt fra Ensembl genomet leseren (https://www.ensembl.org). Når du utformer en morpholino for bruk i både overflaten og hulen boligen, er det avgjørende å identifisere alle genetisk variasjon mellom morphs på dette stadiet, slik disse genetisk områder kan unngås som mål for morpholinos. En polymo…

Representative Results

Flere bestander av hule-bolig A. mexicanus viser redusert søvn og økt våkenhet/aktivitet i forhold til deres overflaten-bolig fra Art14. Hypocretin/orexin (HCRT) er en høyt konservert neuropeptide, som fungerer for å øke våkenhet, avvik i HCRT veien forårsake narkolepsi i mennesker og andre pattedyr47,48. Vi har tidligere vist at hule A. mexicanus økt uttrykk for HCRT peptid, antyder at det økt uttrykket for den…

Discussion

Her gitt vi en metode for å manipulere gen funksjon morpholinos, CRISPR/Cas9 gene redigering og transgenesis metodikk. Vell av genetisk teknologi og optimalisering av disse systemene i sebrafisk vil trolig tillate overføring av disse verktøyene i A. mexicanus med letthet52. Nyere funn har brukt disse metodene i A. mexicanus, men de forblir underutilized etterforskningen av ulike morfologiske, utviklingsmessige og atferdsmessige egenskaper i dette systemet30</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker Sunishka Thakur for henne hjelp i genotyperingteknologi og tenkelig oca2 mutant fisken avbildet i figur 2. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (NSF) prisen 1656574 til A.C.K., NSF award 1754321 JK og A.C.K., og National Institutes of Health (NIH) award R21NS105071 A.C.K. og E.R.D.

Materials

Fish breeding & egg supplies
Fine mesh fish net Penn Plax BN4
Fish tank heater Aqueon 100106108
Egg traps Custom made NA Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs
Glass pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
Pipette bulbs Fisher Scientific 03-448-21
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Egg molds Adaptive Science Tools TU-1
Morpholino supplies
Control Morpholino Gene Tools, LLC Standard control olio
Custom Morpholino Gene Tools, LLC NA
Phenol Red Sigma Aldrich P0290-100ML
CRISPR supplies
Cas9 Plasmid AddGene 46757
GoTaq DNA Polymerase Promega M3001
KOD Hot Start Taq EMD Millipore 71-842-3
Primers Integrated DNA Technologies Custom
T7 Megascript Kit Ambion/Thermofisher AM1333
miRNeasy Kit Qiagen 217004
mMessage mMachine T3 kit Ambion/Thermofisher AM1348
MinElute Kit Qiagen 28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TP plasmid Kawakami et al., 2004 Request from senior author
CutSmart Buffer New England Biolabs B7204
NotI-HF Restriction Enzyme New England Biolabs R3189
PCR purification Kit Qiagen 28104
SP6 mMessenger Kit Ambion/Thermofisher AM1340
Microinjection supplies
Glass Capillary Tubes Sutter Instruments BF100-58-10
Pipette puller Sutter Instruments P-97
Picoinjector Warner Instruments PLI-100A
Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Micromanipulator Stand World Precision Instruments M10
Micmanipulator Base World Precision Instruments Steel Plate Base, 10 lbs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Darwin, C. . On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , (1859).
  2. Culver, D. C., Pipan, T. . The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , (2009).
  3. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
  4. Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
  5. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
  6. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
  7. Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
  8. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  9. Yoshizawa, M., Gorički, &. #. 3. 5. 2. ;., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  10. Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  11. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
  12. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  13. Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  14. Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  15. Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
  16. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  17. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  18. Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
  19. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  20. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
  21. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  22. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
  23. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  24. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  25. Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
  26. Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
  27. Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  28. Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
  29. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
  30. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  31. Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
  32. Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
  33. Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
  34. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
  35. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  36. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
  37. Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
  38. Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
  39. Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
  40. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
  41. Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
  42. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  43. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  44. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  45. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  46. Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
  47. Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
  48. Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
  49. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  50. Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
  51. Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
  52. Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
  53. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
  54. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
  55. Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
  56. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
  57. Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
  58. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  59. Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
  60. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
  61. Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  62. Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
  63. Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
  64. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).

Tags

Cave FishAstyanax MexicanusGene Function ManipulationMorpholinoCRISPRTol2 TransposaseGenetic ToolsDevelopmental BiologyModel Organism
check_url/59093?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stahl, B. A., Jaggard, J. B., Chin, J. S., Kowalko, J. E., Keene, A. C., Duboué, E. R. Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (146), e59093, doi:10.3791/59093 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image