Manipulation av geners funktion i mexikanska släktet
Summary
Vi beskriver metoder för manipulering av gener i den evolutionära modellsystem Astyanax mexicanus. Beskrivs tre olika tekniker: Tol2-medierad genmodifiering, riktade manipulering av genomet med CRISPR/Cas9 och överväldigande uttryck med hjälp av morpholinos. Dessa verktyg bör underlätta direkt undersökning av gener som ligger bakom variationen mellan surface – och grotta-bostad former.
Abstract
Cave djur ger ett tvingande system för att undersöka den evolutionära mekanismer och genetiska baser underliggande förändringar i många komplexa egenskaper, inklusive ögat degeneration, albinism, sömnbrist, hyperfagi och sensorisk bearbetning. Arter av släktet från hela världen visar en konvergent evolution av morfologiska och beteendemässiga egenskaper på grund av delade miljöbelastningar mellan olika grottsystem. Skiftande cave arter har studerats i en laboratoriemiljö. Den mexikanska tetra, Astyanax mexicanus, med synskadade och blinda former, har gett unika insikter i biologiska och molekylära processer som ligger bakom utvecklingen av komplexa egenskaper och är väl redo som en framväxande modellsystem. Även kandidatgener reglera utvecklingen av olika biologiska processer har identifierats i A. mexicanus, har möjligheten att validera en roll för enskilda gener begränsats. Tillämpningen av genmodifiering och genredigering tekniken har potential att övervinna denna påtagligt hämmas och att undersöka mekanismerna bakom utvecklingen av komplexa egenskaper. Här beskriver vi en annan metod för att manipulera genuttryck i A. mexicanus. Metoder inkluderar användning av morpholinos, Tol2 genmodifiering, och genredigering system, vanligen används i Zebrafiskar och andra fiskar modeller, för att manipulera geners funktion i A. mexicanus. Dessa protokoll innehåller detaljerade beskrivningar av tidsbestämda avel förfaranden, insamling av befruktade ägg, injektioner och valet av genetiskt modifierade djur. Dessa metoder kommer att möjliggöra utredningen av genetiska och neurala mekanismerna bakom utvecklingen av olika drag i A. mexicanus.
Introduction
Sedan Darwins Origin of Species1, har forskare fått djupa insikter om hur egenskaper är formade evolutionärt svar på definierade miljömässiga och ekologiska tryck, tack vare cave organismer2. Den mexikanska tetra, A. mexicanus, består av eyed fäderneärvda ‘yta’ populationer som bebor floder i hela Mexiko och södra Texas och minst 29 geografiskt isolerade populationer av härledda cave morphs bebor den Sierra del Abra och andra områden i nordöstra Mexiko3. Ett antal grottan-associerade egenskaper har identifierats i A. mexicanus, inklusive förändrad syreförbrukning, pigmentborttagning, förlust av ögon och förändrad utfodring och födosök beteende4,5,6, 7,8,9. A. mexicanus presenterar en kraftfull modell för att undersöka mekanismer av konvergent evolution på grund av en väldefinierad evolutionära historia, en detaljerad karakterisering av ekologiska miljön och förekomsten av självständigt utvecklats cave populationer10,11. Många av de cave-härledda egenskaper som finns i släktet, inklusive ögat förlust, sova förlust, ökade utfodring, förlust av skolgång, minskad aggressivitet, och minska stressreaktioner, har utvecklats flera gånger genom oberoende ursprung, ofta utnyttja olika genetiska vägar mellan grottorna8,12,13,14,15. Detta upprepas evolution är en kraftfull aspekt av A. mexicanus systemet och kan ge insikt i den mer allmänna frågan om hur genetiska system kan vara orolig för att generera liknande fenotyper.
Medan tillämpningen av genteknik för mekanistiska utredning av geners funktion har begränsats i många fiskarter (inklusive A. mexicanus), ger senaste framstegen inom Zebrafiskar en grund för genetiska teknikutveckling i fisk 16,17,18,19,20. Många verktyg används allmänt i Zebrafiskar för att manipulera genuttryck och genomförandet av dessa förfaranden har länge standardiserats. Till exempel injektion av morpholino oligos (MOs) i singel-cellstadie selektivt blockerar RNA och förhindrar översättning för en kort tidsmässiga fönster under utveckling21,22. Dessutom genredigering metoder, såsom klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) / CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) och transkription aktivator-liknande effektor nuclease (TALEN), möjliggör generering av definierade borttagningar eller, i vissa fall, infogningar genom en rekombination i genomen19,20,23,24. Genmodifiering används för att manipulera stabil genuttryck eller funktion i en cell-typ specifika sätt. Tol2 systemet används effektivt att generera transgena djur genom coinjecting transposase mRNA med en Tol2 DNA plasmid som innehåller en transgenens25,26. Tol2 systemet utnyttjar den Tol2 transposase av medaka att generera stabila könsceller införanden av transgena construct17. Generera Tol2 transgenics innebär coinjecting en plasmid som innehåller en transgenens flankerad av Tol2 integration platser och mRNA för Tol2 transposase17. Detta system har använts för att generera en array av transgena linjerna i Zebrafiskar och dess användning har nyligen expanderat till ytterligare framväxande modellsystem, inklusive ciklider, killifish, Småspigg, och, mer nyligen, den mexikanska släktet27, 28,29,30.
Medan släktet är ett fascinerande biologiska system för klarlägga mekanismer av drag evolution, har dess fulla kapacitet som en evolutionär modell inte varit fullt utnyttjas. Detta har delvis berott på en oförmåga att manipulera genetiska och cellulär funktion direkt31. Kandidatgener reglera komplexa egenskaper har identifierats med hjälp av kvantitativa loci (QTL) studier, men validering av dessa kandidatgener har varit svårt32,33,34. Nyligen, övergående knockdown använder morpholinos, gen redigering med CRISPR och TALEN, och användning av Tol2-medierad genmodifiering har använts för att undersöka den genetiska grunden bakom ett antal drag35,36,37 ,38. Genomförande och standardisering av dessa tekniker möjliggör manipulationer som förhöra den molekylära och neurala underbyggnaden av biologiska egenskaper, inklusive manipulering av geners funktion, märkning av definierade cellpopulationer, och uttrycket av funktionella reportrar. Medan ett framgångsrikt genomförande av dessa genetiska verktyg för att manipulera genen eller cellulär funktion har påvisats i framväxande modellsystem, saknas fortfarande detaljerade protokoll i A. mexicanus.
A. mexicanus ger kritisk insikt om mekanismerna för evolution i svar på en föränderlig miljö och närvarande möjlighet att identifiera nya gener som reglerar olika egenskaper. Ett antal faktorer tyder på att A. mexicanus är en extremt lätthanterlig modell för att tillämpa etablerade genomisk verktyg som för närvarande finns i etablerade genetiska modeller, inklusive möjligheten att enkelt underhålla fisk i laboratorier, stor barnaskara storlek, öppenhet, ett sekvenserat genomet och definierade beteendemässiga analyser39. Här, beskriver vi en metod för användning av morpholinos, genmodifiering och gen redigering i ytan och grottan populationer av A. mexicanus. En bredare tillämpning av dessa verktyg i A. mexicanus möjliggör en mekanistisk utredning de molekylära processer som ligger bakom utvecklingen av utvecklingsmässiga, fysiologiska och beteendemässiga skillnader mellan släktet och ytan fisk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, gav vi en metodik för att manipulera geners funktion med morpholinos, CRISPR/Cas9 gen redigering och genmodifiering metodik. Rikedomen av genteknik och optimering av dessa system i Zebrafiskar sannolikt möjliggör överföring av dessa verktyg till A. mexicanus med lätthet52. Nya rön har använt dessa metoder i A. mexicanus, men de förblir underutnyttjade i utredningen av olika morfologiska, utvecklingsmässiga och beteendemässiga egenskaper i detta system<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Sunishka Thakur för hennes hjälp i genotypning och imaging oca2 mutant fisk avbildas i figur 2. Detta arbete stöddes av National Science Foundation (NSF) award 1656574 till A.C.K., NSF award 1754321 till J.K. och A.C.K., och National Institutes of Health (NIH) award R21NS105071 A.C.K. och E.R.D.
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
References
- Darwin, C. . On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , (1859).
- Culver, D. C., Pipan, T. . The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , (2009).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
- Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
- Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Yoshizawa, M., Gorički, &. #. 3. 5. 2. ;., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
- Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
- Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
- Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
- Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
- Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
- Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
- Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
- Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
- Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
- Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
- Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
- Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
- Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
- Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
- Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
- Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).
