Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Summary

Descriviamo gli approcci per la manipolazione dei geni nel sistema modello evolutivo Astyanax mexicanus. Sono descritti tre diverse tecniche: transgenesi Tol2-mediata, mirata manipolazione del genoma utilizzando CRISPR/Cas9 e atterramento di espressione utilizzando morpholinos. Questi strumenti dovrebbero facilitare l'indagine diretta di geni alla base della variazione tra forme di superficie e caverne.

Abstract

Grotta di animali forniscono un sistema convincente per indagare i meccanismi evolutivi e le basi genetiche alla base di cambiamenti in numerosi tratti complessi, tra cui la degenerazione degli occhi, albinismo, perdita di sonno, iperfagia ed elaborazione sensoriale. Specie di caverna da tutto il mondo visualizzare un'evoluzione convergente dei tratti morfologici e comportamentali a causa di pressioni ambientali condivisi tra sistemi differenti della caverna. Grotta diverse specie sono state studiate nell'impostazione del laboratorio. Il tetra messicano, Astyanax mexicanus, con forme di ipovedenti e non vedenti, ha fornito le comprensioni uniche nei processi biologici e molecolari che sono alla base dell'evoluzione dei tratti complessi ed è ben studiato come sistema modello emergenti. Mentre in a. mexicanus, sono stati identificati geni che regolano l'evoluzione di diversi processi biologici, la possibilità di convalidare un ruolo per singoli geni è stata limitata. L'applicazione della transgenesi e modifica del gene tecnologia ha il potenziale per superare questo ostacolo significativo e per studiare i meccanismi alla base dell'evoluzione dei tratti complessi. Qui, descriviamo una metodologia diversa per la manipolazione di espressione genica in a. mexicanus. Approcci includono l'uso di morpholinos, Tol2 transgenesi, e modelli di sistemi gene-editing, comunemente utilizzati in zebrafish e altri pesci di funzione del gene in a. mexicanusdi manipolare. Questi protocolli includono le descrizioni dettagliate delle procedure di allevamento temporizzata, la raccolta di uova fecondate, iniezioni e la selezione di animali geneticamente modificati. Questi approcci metodologici permetterà per l'indagine dei meccanismi genetici e neurali che l'evoluzione dei diversi tratti in a. mexicanus.

Introduction

Da allora di Origine delle speciedi Darwin¹, gli scienziati hanno acquisito profonde intuizioni come tratti sono modellati evolutivamente in risposta a pressioni ambientali ed ecologiche definite, grazie alla grotta organismi². Il tetra messicano, a. mexicanus, consiste di eyed popolazioni 'superficie' ancestrale che popolano fiumi tutto il Messico e il Texas del sud e di almeno 29 popolazioni geograficamente isolate di morph grotta derivata che abitano la Sierra del Abra e altre zone del Messico nord-orientale³. Un numero di tratti di grotta-collegati è stato identificato in

Protocol

1. Morpholino oligo design

Nota: Sequenze per a. mexicanus sono disponibili attraverso National Center di Biotechnology Information (NCBI) Gene e NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), nonché dal browser genoma Ensembl (https://www.ensembl.org). Quando si progetta un morpholino per l'uso in entrambe le forme caverna-dimora e di superficie, è fondamentale per identificare qualsiasi variazione genetica tra il morphing in questa fase, quindi queste regioni genetiche possono essere evitate come bersagli per morpholinos. Qualsiasi variazione polimorfica all'interno di un sito di destinazione di morpholino può condurre all'associazione i....

Results

Popolazioni più della caverna-dimora a. mexicanus mostrano ridotta sonno e veglia/attività aumentata rispetto al loro conspecifici di superficie-abitazione¹⁴. Ipocretina/orexina (HCRT) è un neuropeptide altamente conservato, che agisce per aumentare lo stato di Veglia, e aberrazioni nella via HCRT causano narcolessia in esseri umani ed altri mammiferi^47,48. Precedentemente abbiamo dimostrato quella grotta a. mexicanus han.......

Discussion

Qui, abbiamo fornito una metodologia per la manipolazione di funzione del gene usando morpholinos, CRISPR/Cas9 gene editing e metodologia di transgenesi. La ricchezza della tecnologia genetica e l'ottimizzazione di questi sistemi in zebrafish consentirà probabilmente per il trasferimento di questi strumenti a. mexicanus con facilità⁵². Recenti scoperte hanno utilizzato questi approcci in a. mexicanus, ma rimangono sottoutilizzate nell'indagine su diversi tratti morfologici, dello.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allevamento di pesci e forniture per uova
Rete per pesci a maglia fine	Penn Plax	BN4
Riscaldatore per acquario	Aqueon	100106108
Trappole per uova NA	su misura		Progetta e crea una griglia di plastica da posizionare sul fondo della vasca per proteggere le uova
Pipette di vetro	Fisher Scientific	13-678-20C
Pipette di bulbi	Fisher Scientific	03-448-21
Agarosio	Fisher Scientific	BP160-500
Stampi per uova	Adaptive Science Tools	TU-1
Morpholino supplies
Control Morpholino	Gene Tools, LLC	Olio
standard Custom Morpholino	Gene Tools, LLC	NA
Fenolo Rosso	Sigma Aldrich	P0290-100ML
em>CRISPR forniture
Cas9 Plasmide	AddGene	46757
GoTaq DNA polimerasi	Promega	M3001
KOD Hot Start Taq	EMD Millipore	71-842-3
Primer	Tecnologie DNA integrate Kit	personalizzato
T7 Megascript Ambion	/Thermofisher	AM1333
miRNeasy Kit	Qiagen	217004
mMessage mMachine T3 kit	Ambion/Thermofisher	AM1348
MinElute Kit	Qiagen	28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TP plasmide	Kawakami et al., 2004	Richiesta dell'autore
CutSmart Buffer	New England Biolabs	B7204
NotI-HF Restriction Enzyme New	England Biolabs	R3189
PCR purification Kit	Qiagen	28104
SP6 mMessenger Kit	Ambion/Thermofisher	AM1340
Microinjection forniture
Tubi capillari in vetro	Sutter Instruments	BF100-58-10
Estrattore per pipette	Sutter Instruments	P-97
Picoinjector	Warner Instruments	PLI-100A
Micromanipolatore	World Precision Instruments	M3301R
per micromanipolatore	World Precision Instruments	M10
Micmanipulator Base	World Precision Instruments	Base in lamiera d'acciaio World Precision Instruments, 10 libbre