3-आयामी कोशिका संस्कृति में अग्नाशय कोष्ठकी-टू-डक्टर Metaplasia की नकल उतारना और हेर-फेर करना
Summary
प्राथमिक कोष्ठकी कोशिका अलगाव, प्रोटीन अभिव्यक्ति या गतिविधि मॉडुलन, संस्कृति, और नीचे धारा अनुप्रयोगों कोष्ठकी-to-डक्टर metaplasia (ADM), अग्नाशय के कैंसर के विकास में एक प्रारंभिक घटना के पूर्व vivo अध्ययन में प्रचुर मात्रा में उपयोगी होते हैं ।
Abstract
अग्नाशयशोथ के दौरान और अग्नाशय के कैंसर के प्रारंभिक विकास में नलिकात्मक कोशिकाओं को कोष्ठकी कोशिकाओं के भेदभाव एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है कि आगे के अध्ययन की आवश्यकता है । कोष्ठकी-to-डक्टर metaplasia (ADM) को विनियमित करने वाले तंत्रों को समझने के लिए, पूर्व विवो 3d संस्कृति और नलिकात्मक कोशिकाओं को प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं के भेदभाव अन्य प्रणालियों पर कई लाभ प्रदान करता है. तकनीक के साथ साथ, प्रोटीन अभिव्यक्ति का मॉडुलन सरल और जल्दी है, को अलग करने के लिए केवल एक दिन की आवश्यकता होती है, उत्तेजित या वायरल संक्रमित, और ADM प्रक्रिया की जांच करने के लिए प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं संवर्धन शुरू करते हैं । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का उपयोग करने के लिए इसके विपरीत में, कोलेजन मैं extracellular मैट्रिक्स में कोष्ठकी सेल क्लस्टर के सीडिंग, कोष्ठकी कोशिकाओं हेरफेर से पहले अपने कोष्ठकी पहचान बनाए रखने के लिए अनुमति देता है । यह महत्वपूर्ण है जब ADM की प्रेरण करने के लिए विभिंन घटकों के योगदान का परीक्षण । न केवल साइटोकिंस या अंय ectopically प्रशासित कारकों का प्रभाव इस तकनीक के माध्यम से परीक्षण कर रहे हैं, लेकिन आम उत्परिवर्तनों के योगदान, प्रोटीन अभिव्यक्ति वृद्धि हुई है, या प्रोटीन अभिव्यक्ति के पछाड़ना वायरल संक्रमण के माध्यम से परीक्षणीय है प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं, adenoviral या lentiviral वैक्टर का उपयोग कर । इसके अलावा, कोशिकाओं को फिर से समापन बिंदु पर कोलेजन या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से अलग और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है ।
Introduction
कोष्ठकी-to-डक्टर metaplasia (ADM) अग्नाशयशोथ के दौरान एक सुरक्षात्मक तंत्र और एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया अग्नाशय के कैंसर के विकास के ड्राइविंग1 कि आगे यंत्रवत अंतर्दृष्टि की आवश्यकता है । जबकि सूजन प्रेरित ADM प्रतिवर्ती2, oncogenic KRAS उत्परिवर्तनों, जो अग्नाशय के कैंसर के मामलों3के ९०% में मौजूद हैं, एक कोष्ठकी phenotype4,5 करने के लिए वापस भेदभाव को रोकने, 6. संवर्धन और 3 डी संस्कृति में वाहिनी कोशिकाओं में अंतर प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं ADM प्रक्रिया है, जो vivo में अध्ययन करने के लिए मुश्किल है विनियमन आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । इस तरह के पूर्व vivo अध्ययन ADM, इसके ड्राइवरों और उसके नियामकों के वास्तविक समय दृश्य सक्षम करें । ADM प्रक्रिया के कई ड्राइवरों, साथ ही उनके बहाव संकेत मार्ग पर यंत्रवत अंतर्दृष्टि, पहचान की गई है या यहां वर्णित विधि का उपयोग कर सत्यापित । इन TGF द्वारा ADM प्रेरण शामिल-α (विकास कारक अल्फा बदलने)-एमएमपी की मध्यस्थता अभिव्यक्ति-7 (मैट्रिक्स metalloproteinase-7) और7पायदान के सक्रियकरण, साथ ही rants (सक्रियण पर विनियमित, सामान्य टी सेल व्यक्त की है और स्रावित; भी जाना जाता के रूप में chemokine ligand 5 या CCL5) और TNFα (ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा)-NF-κB (नाभिकीय फैक्टर-κB)8के सक्रियण के माध्यम से प्रेरित ADM । adm के एक अतिरिक्त मध्यस्थ oncogenic KRas9,10है, जो ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि के कारण EGFR (एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर) और उसके लाइगैंडों, EGF की वृद्धि की अभिव्यक्ति के माध्यम से ADM प्रक्रिया को बढ़ाता है, है ( एपिडर्मल वृद्धि कारक) और TGF-α11.
जबकि अग्नाशय के कैंसर के सेल लाइनों का उपयोग इन विट्रो अध्ययनों के लिए आम है, प्राथमिक सेल संस्कृतियों कई लाभ प्रदान करते हैं । उदाहरण के लिए, गैर-ट्रांसजेनिक चूहों या चूहों KrasG12Dके रूप में उत्परिवर्तनों की शुरुआत बंदरगाह, से प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं, ADM की प्रारंभिक घटना का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त मॉडल है क्योंकि कोशिकाओं को कुछ और नियंत्रित उत्परिवर्तनों है, जो अग्नाशय के कैंसर के विकास में जल्दी उपस्थित होने के लिए जाना जाता है । यह कई अग्नाशय के कैंसर सेल लाइनों जो कई उत्परिवर्तनों और विभिंन मार्ग संख्या12के आधार पर अभिव्यक्ति की है इसके विपरीत में है । इसके अतिरिक्त, इस तरह के माध्यम से पहचान संकेत मार्ग पशु अध्ययन द्वारा सत्यापित किया गया है । प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं का उपयोग कर के एक चेतावनी है कि वे विशिष्ट कैंसर सेल लाइनों के रूप में transfected नहीं किया जा सकता है ।
विधि कोष्ठकी सेल अलगाव, 3 डी संस्कृति कि उत्तेजक या adenoviral या lentiviral संक्रमण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पुन: समापन बिंदु पर कोशिकाओं के अलगाव के माध्यम से जोड़कर ADM नकल की तकनीकों का विवरण आगे विश्लेषण के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
अलगाव, संक्रमण, और चढ़ाना प्राथमिक कोष्ठकी कोशिकाओं के लिए समय की अपेक्षाकृत कम राशि इस पद्धति का एक लाभ है । इसके विपरीत, एक explant वृद्धि से संवर्धन कोष्ठकी कोशिकाओं को थोड़ा हाथ समय पर की आवश्यकता है, लेक…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए एक R01 अनुदान (CA200572) NIH से पी एस के द्वारा समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण में कोई भूमिका नहीं थी, के लिए निर्णय प्रकाशित करें, या पांडुलिपि की तैयारी ।
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
Riferimenti
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