Etterligne og manipulere bukspyttkjertelen Acinar til Ductal Metaplasi i 3-dimensjonale cellekultur
Summary
Primære acinar cellen aisolering, protein uttrykk eller aktivitet modulasjon, kultur og ned-stream programmer er helt nyttig i ex vivo studie av acinar til ductal Metaplasi (ADM), en tidlig hendelse i utviklingen av bukspyttkjertelkreft.
Abstract
Differensiering av acinar celler ductal celler under pankreatitt og i den tidlige utviklingen av bukspyttkjertelkreft er en viktig prosess som krever videre studier. For å forstå mekanismene gir regulerer acinar til ductal Metaplasi (ADM), ex vivo 3D kultur og differensiering av primære acinar celler ductal celler mange fordeler over andre systemer. Med teknikken her er modulering av protein uttrykk enkel og rask, krever bare én dag å isolere, stimulere eller virally infisere og begynne dyrking primære acinar celler for å undersøke ADM prosessen. I motsetning til hjelp av kjelleren membran matrise, den såing av acinar celle klynger i kollagen jeg ekstracellulær matrix, lar acinar celler å beholde sin acinar identitet før manipulering. Dette er viktig når testing bidrag av ulike komponenter til induksjon av ADM. Ikke bare er effekten av cytokiner eller andre ectopically administrert faktorer testbare gjennom denne teknikken, men bidraget fra vanlige mutasjoner, økt protein uttrykk eller knockdown protein uttrykk er testbare via viral infeksjon av primære acinar celler, ved hjelp av adenoviral eller lentiviral vektorer. Videre celler kan være nytt isolert fra kollagen eller kjelleren membran matrise på sluttpunktet og analysert for protein uttrykk.
Introduction
Acinar til ductal Metaplasi (ADM) er en beskyttende mekanisme pankreatitt og en viktig prosess kjører bukspyttkjertelkreft utvikling1 som krever ytterligere mekanistisk innsikt. Mens betennelse-indusert ADM er reversibel2, hindre kreftfremkallende KRAS mutasjoner, som finnes i 90% av bukspyttkjertelkreft tilfeller3, differensiering tilbake til en acinar fenotypen4,5, 6. Culturing og skille primære acinar celler i ductal celler i 3D kultur tillater studie av molekylære mekanismer regulere ADM prosessen, som er vanskelig å studere i vivo. Slike ex vivo studier aktiverer sanntids visualisering av ADM, driverne og sine regulatorer. Flere drivere av ADM prosessen, samt mekanistisk innsikt i deres nedstrøms signalveier, har blitt identifisert eller bekreftet bruker her beskrevet metoden. Disse inkluderer ADM induksjon av TGF-î± (alfa-transformere vekstfaktor)-mediert uttrykk for MMP-7 (matrise metalloproteinase-7) og aktivering av hakk7, samt RANTES (reguleres på aktivisering, normal T celle uttrykt og utskilles; også kjent som chemokine ligand 5 eller CCL5) og TNFα (tumor nekrose faktor alfa)-indusert ADM gjennom aktivering av NF-κB (kjernefysiske faktor-κB)8. En ekstra formidler av ADM er kreftfremkallende KRas9,10, som fører til en økning i oksidativt stress som forbedrer ADM prosessen gjennom økt uttrykk for EGFR (epidermal vekstfaktor reseptor) og dens ligander, EGF ( epidermal vekstfaktor) og TGF-α11.
Bruk av bukspyttkjertelkreft linjer er vanlig for in vitro studier, tilby primært cellekulturer mange fordeler. For eksempel, primære acinar celler fra ikke-transgene mus eller mus skjuler initiering mutasjoner, som KrasG12D, er den mest passende modellen for å studere hendelsen tidlig for ADM fordi cellene har noen og kontrollert mutasjoner, som kjent for å være tidlig i bukspyttkjertelkreft utvikling. Dette er i kontrast til mange bukspyttkjertelkreft cellelinjer som har flere mutasjoner og variert uttrykk basert på passering nummer12. I tillegg har signalveier identifisert av slike midler blitt bekreftet av dyrestudier. En påminnelse ved å bruke primære acinar celler er at de ikke kan være transfected som typisk kreftcelle linjer kan.
Metoden her detaljer teknikker av acinar cellen aisolering, 3D kultur som etterligner ADM ved å legge sentralstimulerende midler eller modulerende protein uttrykk via adenoviral eller lentiviral, samt re isolering av celler på endepunktet for videre analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den relativt kort tidsperiode for isolasjon, infeksjon og plating primære acinar celler er en fordel med denne metoden. Derimot dyrking acinar celler fra en explant utvekst krever lite hands-on tid, men det tar sju dager for resultatet av acinar celler13. En alternativ protokoll for acinar isolasjon14 notater en svært kort metode for å få acinar celler. men er EGF en viktig komponent i å holde acinar cellene i live når isolert bruker denne protokollen. Siden EGF stimu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en R01 grant (CA200572) fra NIH til PS. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Cancer Institute eller den nasjonale institutter Health.The organer ikke hadde noen rolle i studie design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere, eller manuskriptet.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
Riferimenti
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Ricerca sul cancro. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
