Efterligne og manipulere med pancreas Acinar til duktalt metaplasi i 3-dimensionelle cellekultur
Summary
Primære acinar celle isolation, protein udtryk eller aktivitet graduering, kultur og down-stream programmer er særdeles nyttige i ex vivo undersøgelse af acinar til duktalt metaplasi (ADM), en tidlig begivenhed i udviklingen af kræft i bugspytkirtlen.
Abstract
Differentiering af acinar celler til duktalt celler under pancreatitis og i den tidlige udvikling af kræft i bugspytkirtlen er en vigtig proces, der kræver yderligere undersøgelse. For at forstå mekanismerne, der tilbyder regulerer acinar til duktalt metaplasi (ADM), ex vivo 3D kultur og differentiering af primær acinar celler til duktalt celler mange fordele i forhold til andre systemer. Med teknikken heri er graduering af protein udtryk enkel og hurtig, som kræver kun én dag til at isolere, stimulere eller viralt inficere og begynde, dyrkning af primære acinar celler til at undersøge ADM proces. I modsætning til ved hjælp af basalmembranen matrix, seeding af acinar celle klynger i kollagen jeg ekstracellulære matrix, giver mulighed for acinar celler til at bevare deres acinar identitet før manipulation. Dette er afgørende, når afprøvning af forskellige komponenter til induktion af ADM. bidrag Ikke alene er effekt af cytokiner eller andre ectopically administreret faktorer testbare gennem denne teknik, men bidrag af almindelige mutationer, øget protein udtryk eller knockdown ekspression af proteiner er testbare via viral infektion i primære acinar celler, ved hjælp af adenoviral eller lentiviral vektorer. Derudover celler kan isoleres igen fra kollagen eller basalmembranen matrix på slutpunktet og analyseret for protein udtryk.
Introduction
Acinar til duktalt metaplasi (ADM) er en beskyttende mekanisme under pancreatitis og en nøglen oparbejde kørsel bugspytkirtelkræft udvikling1 der kræver yderligere mekanistiske indblik. Mens betændelse-induceret ADM er reversibel2, forhindre muterede KRAS mutationer, der er til stede i 90% af kræft i bugspytkirtlen sager3, differentiering tilbage til en acinar fænotype4,5, 6. Culturing og differentiere primære acinar celler i duktalt celler i 3D kultur giver mulighed for undersøgelse af de molekylære mekanismer, der regulerer ADM proces, som er vanskelige at studere in vivo. Sådan ex vivo undersøgelser aktiverer real-time visualisering af ADM, dets drivere og dens lovgiverne. Flere drivere af ADM proces, samt mekanistiske indblik på deres downstream signaling veje, er blevet identificeret eller verificeret ved hjælp af her beskrevne metode. Disse omfatter ADM induktion af TGF-α (omdanne vækst faktor alfa)-medieret udtryk af MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) og aktivering af Notch7, samt RANTES (reguleret på aktivering, normal T celle udtrykt og udskilles; også kendt som chemokine ligand 5 eller CCL5) og TNFα (tumor nekrose faktor alfa)-induceret ADM gennem aktivering af NF-κB (nuclear factor-κB)8. En yderligere mægler af ADM er muterede KRas9,10, som medfører en stigning i oxidativ stress, som øger ADM proces gennem øget udtryk for EGFR (epidermal vækstfaktor receptor) og dens ligander, EGF ( epidermal vækstfaktor) og TGF-α11.
Mens brugen af pancreas cancer cellelinjer er fælles for in vitro-undersøgelser, giver primære cellekulturer mange fordele. For eksempel, primære acinar celler fra ikke-Transgene mus eller mus husly igangsættende mutationer, såsom KrasG12D, er den mest hensigtsmæssige model for at studere de tidlige begivenhed af ADM fordi cellerne har par og kontrolleret mutationer, som er kendt for at være til stede tidligt i bugspytkirtelkræft udvikling. Dette er i modsætning til mange pancreas cancer cellelinjer, der har flere mutationer og varierede udtryk baseret på passage nummer12. Derudover er signaling veje identificeret af sådanne midler blevet bekræftet ved dyreforsøg. En advarsel af ved hjælp af primær acinar celler er, at de ikke kan være transfekteret, som typisk kræft cellelinjer kan.
Metoden heri detaljer teknikker til acinar celle isolation, 3D kultur, der efterligner ADM ved at tilføje stimulanser eller modulerende protein udtryk via adenoviral eller lentiviral infektion, samt fornyet dyrkning af celler på slutpunktet for yderligere analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den relativt korte tidsrum isolation, infektion og plating primære acinar celler er en fordel ved denne metode. Derimod dyrkning acinar celler fra en eksplantat udvækst kræver lidt hands-on tid, men det tager syv dage for udvækst af acinar celler13. En alternativ protokol for acinar isolation14 bemærker en meget kort metode til at indhente acinar celler; EGF er imidlertid et væsentligt element i at holde acinar celler i live, når isoleret ved hjælp af denne protokol…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en R01 tilskud (CA200572) fra NIH til PS. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Cancer Institute eller de nationale institutter Health.The finansieringskilderne spillede ingen rolle i studere design, dataindsamling og analyse, beslutning om at udgive, eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
Riferimenti
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Ricerca sul cancro. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
