Imitant et manipuler une métaplasie acineux-à-canalaire pancréatique en Culture cellulaire 3D
Summary
Isolement des cellules acineuses primaire, modulation expression ou l’activité de protéines, la culture et des applications en aval sont abondamment utiles ex vivo étude de métaplasie acineux-à-canalaire (SMA), un événement précoce dans le développement du cancer du pancréas.
Abstract
La différenciation des cellules acineuses de canalaire au cours de la pancréatite et dans le développement précoce du cancer du pancréas est un processus essentiel qui nécessite une étude plus approfondie. Pour comprendre les mécanismes de régulation métaplasie acineux-à-canalaire (SMA), ex vivo culture 3D et différenciation des cellules acineuses primaires aux cellules canalaires offre de nombreux avantages par rapport aux autres systèmes. Avec la technique ci-après, modulation de l’expression de la protéine est simple et rapide, nécessitant un seul jour d’isoler, stimuler ou virale infecter et commencer la mise en culture des cellules acineuses primaires afin d’étudier le processus d’ADM. Contrairement à l’utilisation de la matrice de la membrane basale, l’ensemencement des amas de cellules acineuses en collagène I matrice extracellulaire, permet aux cellules acineuses de conserver leur identité acineuse avant toute manipulation. C’est très important lors de l’essai de la contribution des diverses composantes de l’induction de l’ADM. Non seulement les effets des cytokines ou d’autres facteurs de façon ectopique administrées testables grâce à cette technique, mais la contribution de la commune des mutations, expression de la protéine accrue ou précipitation d’expression de la protéine est testable par infection virale du cellules acineuses primaires, à l’aide des vecteurs adénovirus ou des gènes. En outre, les cellules peuvent être ré-isolés du collagène ou de la matrice de la membrane basale au point de terminaison et analysés pour l’expression de la protéine.
Introduction
Métaplasie acineux-à-canalaire (SMA) est un mécanisme de protection au cours de la pancréatite et un processus clé de développement de cancer du pancréas1 qui nécessite une vision mécaniste complémentaire au volant. Alors que l’inflammation induite par la SMA est réversible2, oncogène KRAS mutations, qui sont présentes dans 90 % des cas de cancer du pancréas3, empêchent la différenciation vers un phénotype acineuses4,,5, 6. Culturing et la différenciation des cellules acineuses primaires dans des cellules canalaires en culture 3D permet d’étudier les mécanismes moléculaires régissant le processus d’ADM, qui est difficile à étudier in vivo. Ces ex vivo études permettent la visualisation en temps réel du SMA, ses pilotes et ses régulateurs. Plusieurs pilotes de processus de SMA, et le mécaniste insight sur leurs voies de signalisation en aval, ont été identifiés ou vérifiées à l’aide de l’ici décrit la méthode. Il s’agit d’induction de SMA par TGF-α (alpha de facteur de croissance transformant)-médiée par l’expression de MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) et l’activation de l’encoche7, ainsi que RANTES (réglée sur activation, cellule normale de T exprimée et sécrétée ; également connu chemokine ligand 5 ou CCL5) et TNFα (facteur de nécrose tumorale alpha)-induite par ADM grâce à l’activation de NF-κB (nuclear factor-κB)8. Un médiateur supplémentaire du SMA est oncogène KRas9,10, ce qui provoque une augmentation de stress oxydatif qui améliore le processus de SMA par augmentation de l’expression de l’EGFR (récepteur du facteur de croissance épidermique) et ses ligands, EGF ( facteur de croissance épidermique) et TGF-α11.
Alors que l’utilisation de lignées cellulaires de cancer du pancréas est commune pour des études in vitro, cultures de cellules primaires offrent de nombreux avantages. Par exemple, les cellules acineuses primaires de souris non-transgéniques ou souris associées à des mutations initiatrice, commeG12Dde Kras, sont le modèle le plus approprié pour l’étude de l’événement début du SMA parce que les cellules présentent des mutations rares et contrôlées, qui sont connus pour être présents au début du développement d’un cancer du pancréas. Il s’agit en revanche de nombreuses lignées cellulaires de cancer du pancréas qui présentent des mutations multiples et variées d’expression selon le passage numéro12. En outre, les voies de signalisation identifiés par de tels moyens ont été vérifiées par les études chez l’animal. Une mise en garde de l’utilisation des cellules acineuses primaires, c’est qu’ils ne peuvent pas transfecter possible de lignées cellulaires cancéreuses typique.
La méthode ci-après détaille les techniques d’isolement de cellules acineuses, culture 3D qui imite le SMA en ajoutant des stimulants ou en modulant l’expression de la protéine par infection adénovirale ou des gènes, ainsi que re-isolement de cellules au point de terminaison pour approfondir les analyses.
Protocol
Representative Results
Discussion
La durée relativement courte pour isolement, infection et des cellules acineuses primaires de placage est un avantage de cette méthode. En revanche, cultivant des cellules acineuses d’une excroissance de l’explant nécessite peu de temps pratique, mais il faut sept jours pour l’excroissance des cellules acineuses13. Un protocole alternatif pour isolement acineuses14 note une méthode très courte pour obtenir des cellules acineuses ; Cependant, EGF est une composan…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de R01 (CA200572) du NIH au PS Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de l’Institut National du Cancer ou les instituts nationaux de Health.The bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans étudier la conception, la collecte de données et l’analyse, décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
Riferimenti
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