Imitando e manipulando Metaplasia acinares-para-Ductal pancreático na cultura de pilha 3-dimensional
Summary
Aplicativos de jusante, modulação de expressão ou atividade de proteína, cultura e isolamento primário de células acinares são abundantemente úteis em ex vivo estudo de metaplasia acinares-para-ductal (ADM), um evento precoce no desenvolvimento de câncer no pâncreas.
Abstract
A diferenciação de células acinares para células Ductais durante a pancreatite e no desenvolvimento precoce do câncer de pâncreas é uma chave do processo que requer um estudo mais aprofundado. Para entender os mecanismos de regulação metaplasia acinares-para-ductal (ADM), ex vivo 3D cultura e diferenciação das células acinares primárias de células Ductais oferece muitas vantagens sobre outros sistemas. Com a técnica aqui, modulação da expressão da proteína é simples e rápida, exigindo apenas um dia para isolar, estimular ou infectar Viralmente e iniciar o cultivo de células acinares primárias para investigar o processo ADM. Em contraste com usando a matriz da membrana basal, a semeadura de aglomerados de células acinares em colágeno eu matriz extracelular, permite que as células acinares reter sua identidade acinares antes de manipulação. Isto é vital ao testar a contribuição de vários componentes para a indução da ADM. Não são apenas os efeitos de citocinas ou outros fatores ectopically administrados testável por intermédio da técnica, mas a contribuição de mutações comuns, expressão aumentada da proteína ou nocaute da expressão da proteína é testável através de infecção viral de células acinares primárias, usando vetores adenovírus ou particulas de Lentivirus. Além disso, as células podem ser re-isoladas de colágeno ou matriz da membrana basal no ponto de extremidade e analisaram para a expressão da proteína.
Introduction
O metaplasia acinares-para-ductal (ADM) é um mecanismo de proteção durante a pancreatite e uma chave do processo de desenvolvimento de câncer pancreático1 que requer mais uma visão mecanicista de condução. Enquanto induzida por inflamação ADM é reversível2, oncogênicos KRAS mutações, que estão presentes em 90% dos casos de câncer no pâncreas3, evitar a diferenciação para um fenótipo acinares4,5, 6. Culturing e diferenciar as células acinares primárias em células Ductais em cultura 3D permite o estudo dos mecanismos moleculares que regulam o processo ADM, que é difícil para o estudo in vivo. Tais ex vivo estudos permitem a visualização em tempo real de ADM, seus pilotos e seus reguladores. Foram identificados vários pilotos do processo ADM, bem como uma visão mecanicista sobre suas vias de sinalização a jusante, ou verificadas usar o aqui descrito método. Estes incluem indução de ADM por TGF-α (alfa do fator de crescimento transformador)-mediada por ativação de entalhe7, bem como RANTES (regulada na ativação, normal célula T expressa e secretada; também conhecido e expressão de MMP-7 (matriz metaloproteinase-7) como ligante chemokine 5 ou CCL5) e TNFa (fator de necrose tumoral alfa)-induzida através da ativação de NF-κB (fator nuclear-κB)8de ADM. Um mediador adicional da ADM é oncogênica KRas9,10, que provoca um aumento no estresse oxidativo que aprimora o processo ADM através do aumento da expressão de EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) e seus ligantes, EGF ( fator de crescimento epidérmico) e TGF-α11.
Enquanto o uso de linhas de células de câncer de pâncreas é comum para estudos in vitro, culturas de células primárias oferecem muitas vantagens. Por exemplo, células acinares primárias de não-transgênicos ratos ou camundongos abrigando iniciando mutações, tais como KrasG12D, são o modelo mais adequado para estudar o evento precoce da ADM, porque as células têm mutações alguns e controladas, que são conhecidos para estar presente no início do desenvolvimento de câncer no pâncreas. Isso é em contraste com muitas linhas de células de câncer pancreático que têm mutações múltiplas e variadas de expressão baseada em passagem número12. Além disso, as vias de sinalização identificadas por tais meios foram verificadas por estudos em animais. Uma limitação do uso de células acinares primárias é que eles não podem ser transfectados como linhas de células de câncer típico podem.
O método neste documento detalha as técnicas de isolamento de células acinares, cultura 3D que imita ADM adicionando estimulantes ou modulando a expressão de proteínas via adenovírus ou particulas de Lentivirus de infecção, bem como re-isolamento de células no ponto de extremidade para mais análises.
Protocol
Representative Results
Discussion
A quantidade relativamente curta de tempo para isolamento, infecção e chapeamento de células acinares primárias é uma vantagem deste método. Em contraste, o cultivo de células acinares de uma consequência de explant requer pouco tempo de hands-on, mas demora sete dias para a consequência natural de células acinares13. Um protocolo alternativo para isolamento acinares14 observa um método muito curto para a obtenção de células acinares; no entanto, o EGF é um c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um grant R01 (CA200572) do NIH para PS O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de câncer ou a institutos nacionais de Health.The financiadores não tiveram nenhum papel em estudar design, coleta de dados e análise, a decisão de publicar, ou preparação do manuscrito.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
Riferimenti
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