Härma och manipulera bukspottskörteln Acinar-till-duktal metaplasi i 3-dimensionell cellodling
Summary
Primära acinar cell isolering, protein uttryck eller aktivitet modulering, kultur och nedströms tillämpningar är rikligt användbara i ex vivo studie av acinar-till-duktal metaplasi (ADM), en tidig händelse i utvecklingen av cancer i bukspottskörteln.
Abstract
Differentiering av acinar celler till duktal celler under pankreatit och i den tidiga utvecklingen av cancer i bukspottskörteln är en viktig process som kräver vidare studier. För att förstå mekanismerna som erbjuder reglerar acinar-till-duktal metaplasi (ADM), ex vivo 3D kultur och differentiering av primära acinar celler till duktal celler många fördelar jämfört med andra system. Med tekniken häri är modulering av proteinuttryck enkel och snabb, kräver bara en dag att isolera, stimulera eller viralt infektera och börja odla primära acinar celler för att undersöka ADM processen. I motsats till med basalmembranet matris, odling av acinar cell kluster i kollagen jag extracellulärmatrix, tillåter acinar celler för att behålla deras acinar identitet innan manipulation. Detta är mycket viktigt när du testar olika komponenter till induktion av ADM. bidrag Inte bara är effekterna av cytokiner eller andra ectopically administrerade faktorer testbara genom denna teknik, men bidraget från vanliga mutationer, ökat proteinuttryck eller Nedslagning av proteinuttryck är testbara via virusinfektion primära acinar celler, med hjälp av lentiviral eller adenovirala vektorer. Dessutom celler åter kan isoleras från kollagen eller basalmembranet matris på slutpunkten och analyseras för proteinuttryck.
Introduction
Acinar-till-duktal metaplasi (ADM) är en skyddande mekanism under pankreatit och en viktig process som kör pankreascancer utveckling1 som kräver ytterligare mekanistiska insikter. Även inflammation-inducerad ADM är vändbar2, förhindra onkogena KRAS -mutationer, som är närvarande i 90% av cancer i bukspottskörteln fall3, differentiering tillbaka till ett acinar fenotyp4,5, 6. Culturing och differentiera primära acinar celler i duktal celler i 3D kultur möjliggör studiet av de molekylära mekanismer som reglerar ADM processen, vilket är svårt att studera invivo. Sådan ex vivo studier aktivera realtid visualisering av ADM, dess förare och dess tillsynsmyndigheter. Flera förare av de ADM process som mekanistisk insikt om deras nedströms signalvägar, har identifierats eller verifierade med hjälp av här beskrivna metoden. Dessa inkluderar ADM-induktion av TGF-α (omvandla tillväxtfaktor alpha)-medierade uttryck av MMP-7 (matrix metalloproteinas-7) och aktivering av Notch7, liksom RANTES (reglerat på aktivering, normala T-cell uttryckt och utsöndras; också känt som chemokine ligand 5 eller CCL5) och TNFα (tumörnekrosfaktor alfa)-inducerad ADM genom aktivering av NF-κB (nuclear factor-κB)8. En ytterligare medlare av ADM är onkogena KRas9,10, vilket orsakar en ökning av oxidativ stress som förbättrar ADM processen via ökat uttryck av EGFR (epidermal tillväxtfaktor receptor) och dess ligander, EGF ( Epidermal tillväxtfaktor) och TGF-α11.
Även användning av pankreas cancer cellinjer är vanligt för in vitro-studier, erbjuder primära cellkulturer många fördelar. Exempelvis primära acinar celler från icke-transgena möss eller möss härbärgerat initierande mutationer, såsom KrasG12D, är den lämpligaste modellen för att studera tidiga händelsen av ADM eftersom cellerna har några och kontrollerad mutationer, som är kända för att vara närvarande tidigt i cancer i bukspottskörteln utveckling. Detta är i kontrast till många bukspottskörteln cancer cellinjer som har flera mutationer och varierade uttryck baserat på passagen nummer12. Dessutom har de signalvägar som identifierats av sådana medel verifierats av djurstudier. En varning för att använda primära acinar celler är att de inte kan vara transfekterade typiska cancer cellinjer kan.
Metoden häri Detaljer tekniker för acinar cell isolering, 3D kultur som härmar ADM genom att lägga till stimulantia eller modulerande proteinuttryck via adenovirala eller lentiviral infektion, samt ny isolering av celler vid slutpunkten för ytterligare analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den relativt korta tid för isolering, infektion och plätering primära acinar celler är en fördel med denna metod. Däremot odlingsskålar acinar celler från en explant utväxt kräver lite hands-on tid, men det tar sju dagar för utväxten acinar celler13. Ett alternativt protokoll för acinar isolering14 noterar en mycket kort metod för att erhålla acinar celler; EGF är dock en viktig komponent i att hålla acinar celler levande vid isolerade använder protokollet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av en R01 grant (CA200572) från NIH till PS. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Cancer Institute eller den nationella institut av Health.The finansiärer hade ingen roll i studera design, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
Riferimenti
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Ricerca sul cancro. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
