Alterazioni di modificazione post-traduzionale istone caratterizzante nel lievito Neurodegenerative Proteinopathy modelli
Summary
Questo protocollo delinea le procedure sperimentali per caratterizzare il genoma cambiamenti nei livelli di modifiche post-traduzionali degli istoni (PTM) che si verificano in relazione la sovraespressione di proteine associate con ALS e malattia del Parkinson in Modelli di Saccharomyces cerevisiae . Dopo la separazione di SDS-PAGE, vengono rilevati livelli PTM istone individuali con gli anticorpi specifici di modifiche tramite Western blotting.
Abstract
Malattie neurodegenerative quali la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e malattia di Parkinson (MDP), causano la perdita di centinaia di migliaia di vite ogni anno. Mancano opzioni di trattamento efficace in grado di fermare la progressione di malattia. Nonostante gli sforzi di sequenziamento estesa in grandi popolazioni di pazienti, la maggior parte dei casi di SLA e PD rimanga inspiegabile mutazioni genetiche da solo. Meccanismi di Epigenetics, quali la modificazione post-traduzionale delle proteine istoniche, possono essere coinvolti nella progressione e nella eziologia di malattia neurodegenerative e portano a nuovi bersagli per l’intervento farmaceutico. Modelli di mammiferi in vivo e in vitro di ALS e PD sono costosi e richiedono spesso prolungati e laboriosi protocolli sperimentali. Qui, descriviamo un approccio pratico, veloce e conveniente per determinare alterazioni del genoma nei livelli di modifiche dell’istone usando Saccharomyces cerevisiae come sistema modello. Questo protocollo permette di complete indagini cambiamenti epigenetici collegati al proteinopathies neurodegenerative che confermano i risultati precedenti in sistemi diversi modello allargando significativamente la nostra conoscenza della neurodegenerative malattia epigenoma.
Introduction
Le malattie neurodegenerative sono malattie devastanti con poco o nessun opzioni di trattamento disponibili. Tra questi, la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e malattia di Parkinson (MDP) sono particolarmente terribile. Circa il 90% dei casi di SLA e PD sono considerati sporadici, che si verificano senza storia di famiglia della malattia, mentre i restanti casi funzionare in famiglie e sono generalmente collegati a un gene specifico mutazione1,2. Interessante, entrambe queste malattie sono associate con la proteina mislocalization e aggregazione3,4,5,6. Per esempio, fusa nel sarcoma (FUS) e proteina obbligatoria del DNA del catrame-43 (TDP-43) sono proteine che legano RNA che mislocalize nel citoplasma e aggregare in ALS7,8,9,10, 11,12, mentre α-synuclein è il componente di principio di aggregati proteici chiamati corpi di Lewy in PD5,13,14,15.
Nonostante gli sforzi di vasta associazione genome-wide in grandi popolazioni di pazienti, la stragrande maggioranza dei casi di SLA e PD rimanga inspiegabile geneticamente. Può l’epigenetica svolge un ruolo nella malattia neurodegenerative? Epigenetics comprende cambiamenti nell’espressione genica che si verificano senza cambiamenti a sottostante DNA sequenza16. Un meccanismo epigenetico principale comporta le modifiche post traduzionale (PTM) di istone proteine16. Nelle cellule eucariotiche, il materiale genetico è strettamente avvolto nella cromatina. L’unità di base della cromatina è il nucleosoma, composto da 146 paia di basi del DNA avvolto intorno un istone istonico, è composto da quattro coppie di istoni (due copie ciascuno degli istoni H2A, H2B, H3 e H4)17. Ogni istone ha una coda N-terminale che sporge fuori il nucleosoma e può essere modificato con l’aggiunta di vari moiety chimico, solitamente su di residui di lisina e arginina18. Questi PTMs sono dinamici, il che significa che possono essere facilmente aggiunti e rimossi e includere gruppi quali acetilazione, metilazione e fosforilazione. PTMs determinano l’accessibilità del DNA al macchinario trascrizionale e contribuire così controllo gene espressione18. Ad esempio, acetilazione dell’istone riduce la forza di interazione elettrostatica tra le proteine istoniche altamente basici e la spina dorsale del DNA caricata negativamente, permettendo i geni imballati da istoni acetilati di essere più accessibile e quindi altamente espresso19. Più recentemente, la notevole specificità biologica di PTMs particolare istone e loro combinazioni ha portato all’istone codice ipotesi20,21 in quali proteine che scrivere, cancellare e leggere istone PTMs tutti agiscono di concerto per modulano l’espressione genica.
Il lievito è un modello molto utile per studiare la neurodegenerazione. Soprattutto, molte vie cellulari neuronali sono conservate dal lievito per gli esseri umani22,23,24. Lievito ricapitolano citotossicità fenotipi e inclusioni di proteina all’iperespressione di FUS, TDP-43 o α-synuclein22,23,24,25,26. Infatti, i modelli di Saccharomyces cerevisiae di ALS sono stati utilizzati per identificare fattori di rischio genetici in esseri umani27. Inoltre, il lievito che overexpressing umano α-synuclein ammessi per la caratterizzazione della rete Rsp5 come bersaglio trattabili per migliorare la tossicità di α-synuclein in neuroni28,29.
Qui, descriviamo un protocollo sfruttando Saccharomyces cerevisiae per rilevare le modifiche PTM genoma istone connesse con proteinopathies neurodegenerative (Figura 1). L’uso di S. cerevisiae è molto attraente per la sua facilità d’uso, basso costo e velocità rispetto agli altri modelli in vitro ed animali di neurodegenerazione. Sfruttando precedentemente sviluppato ALS e PD modelli22,23,25,26, noi abbiamo sovraespresso umano FUS, TDP-43 e α-synuclein in lievito e scoperte distinte istone PTM trasformazioni che avvengono in connessione con ogni proteinopathy30. Il protocollo che descriviamo qui può essere completato in meno di due settimane dalla trasformazione all’analisi dei dati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui fornisce un modo semplice, conveniente e redditizio di categorizzare i cambiamenti PTM istone genoma correlati con proteinopathies neurodegenerative. Mentre ci sono altri modelli di ALS e PD, come in vitro murino e linee cellulari umane modelli32, S. cerevisiae rimane attraente per la sua facilità d’uso. Per esempio, modelli di lievito non richiedono l’uso di una cappa sterile, né richiedono l’allenamento che intensivo va con il lavoro della coltura …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Royena Tanaz, Huda Yousuf e Sadiqa Taasen per assistenza tecnica. Siamo molto grati al Prof James Shorter per la generosa fornitura di reagenti e intellettuale assistenza nella progettazione di esperimenti di ottimizzazione di saccarosio. Plasmidi di lievito sono stati un dono generoso da Prof. ssa Aaron Gitler (tra cui 303Gal-FUS; Plasmide Addgene # 29614). Brooklyn College e il centro di ricerca scienza avanzata (CUNY), nonché un NIH NINDS Postdoctoral transizione premio Advanced (K22NS09131401) supportato M.P.T.
Materials
| -His DO Supplement | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8. | ||
| 12% Polyacrylamide Gels | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody | MilliporeSigma | 07-353 (Lot No. 2762291) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody | Abcam | ab109463 (Lot No. GR187780) | Dilution: 1/2000 |
| Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody | Abcam | ab46983 (Lot No. GR71882) | Dilution: 1/5000 |
| Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody | Abcam | ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-Histone H3 Primary Antibody | Abcam | ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335) | Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000 |
| Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody | Abcam | ab188292 (Lot No. GR211874) | Dilution: 1/1000 |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody | Abcam | ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296) | Dilution: 1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Cell Culture Dish (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Cell Culture Plate, 96 well | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Dilution: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Dilution: 1/2500 |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Extra thick blot paper (filter paper) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Prepare 50 % w/v solution. |
| Immobilon-FL Transfer Membranes | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Lithium acetate dihydrate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Prepare a 1 M solution. |
| Loading Dye | Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water. | ||
| Methanol | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Multichannel pipet | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Nuclease Free Water | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | Gift from A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Gift from A. Gitler | ||
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Prepare a 50% w/v solution. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water. |
| PowerPac Basic Power Supply | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | R7630 | Prepare 10% w/v stock solution. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His plates | Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water. | ||
| SGal-His plates | Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water. | ||
| Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer | Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8. | ||
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Prepare 0.2 M solution. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Prepare 20% w/v stock solution. |
| TBS + 0.1% Tween 20 (TBST) | Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water. | ||
| TBS Blocking Buffer | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | 170-3940 | |
| Transfer Buffer | Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water. | ||
| Tris-Buffered Saline (TBS) | 10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water. | ||
| WT 303 S. cerevisiae yeast | Gift from J. Shorter | ||
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
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