Odling av grön mikroalg i bubbla kolumn Photobioreactors och ett test för neutrala lipider

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att konstruera lab-skala bubbla kolumn photobioreactors och använda dem till kultur mikroalger. Det ger också en metod för bestämning av kultur tillväxttakt och neutrala fettinnehållet.

Abstract

Det finns betydande intresse i studien av mikroalger för tekniska applikationer såsom produktion av biobränslen, produkter med högt värde, och för behandling av avfall. Som de flesta nya forskningsinsatser börjar på laboratorieskala, finns det ett behov av kostnadseffektiva metoder för att odla mikroalger i ett reproducerbart sätt. Här, kommunicerar vi en effektiv strategi för kultur mikroalger i laboratorieskala photobioreactors och att mäta tillväxt och neutrala fettinnehållet i de algerna. Instruktioner finns också på hur du ställer in photobioreactor systemet. Även om exempel organismerna är arter av Chlorella och Auxenochlorella, kan detta system anpassas för att odla ett brett utbud av mikroalger, inklusive samtidig kulturer av alger med icke-alger arter. Beståndet kulturer odlas först i flaskor att producera inokulum för photobioreactor system. Alger inokulum är koncentrerad och överförs till photobioreactors för odling i batch-läge. Prover tas dagligen för Absorbansavläsningar. I slutet av batch kultur, celler skördas av centrifug, tvättas, och frysa torkade att erhålla en slutlig torrvikt koncentration. Den slutliga torrvikt koncentrationen används för att skapa ett samband mellan den optiska densiteten och torrvikt koncentrationen. En modifierad Folch metod används därefter att extrahera sammanlagda mängden lipider från den frystorkade biomassan och extraktet har analyserats för dess neutrala fetthalten med en mikroplattan-analys. Denna analys har publicerats tidigare men protokollstegen ingick här Markera kritiska steg i förfarandet där fel inträffar ofta. Bioreaktor systemet beskrivs här fyller en nisch mellan enkel kolv odling och fullt kontrollerade kommersiella bioreaktorer. Även med bara 3-4 biologiska replikerar per behandling, vår metod för att odla alger leder till snäva standardavvikelser i tillväxt och lipid analyserna.

Introduction

Tillämpningen av mikroalger i teknik och bioteknik har rönt stort intresse under de senaste åren. Mikroalger studeras för användning i avloppsvatten behandling^1,2,3,4, biobränsle produktion^5,6,7,8, och produktion av nutraceuticals och andra värdefulla produkter^9,10. Alger är också att vara genetiskt modifierade på större priser i ett försök att förbättra deras lämplighet för särskilda engineering program^11,12. Följaktligen finns det stort intresse för experiment med industriellt relevanta organismer i kontrollerade miljöer. Syftet med denna metod är att kommunicera en effektiv strategi för kultur mikroalger i kontrollerad laboratoriemiljö och att mäta tillväxt och neutrala fettinnehållet i de algerna. Att förbättra tillväxten priser och neutrala fettinnehållet i mikroalger har identifierats som två viktiga flaskhalsar mot kommersialisering av alger biobränslen¹³.

En rad olika metoder har använts för att kultur alger i experimentsyfte. Dessa strategier kan i allmänhet delas mellan storskalig utomhus odling och småskalig inomhus odling. Utomhus odling i photobioreactors och öppna dammar är lämplig för experiment som syftar till att skala upp processer som har redan visat på laboratorieskala (t.ex. att testa skala upp av en ny hög-lipid stam av alger)¹⁴. Men inomhus småskalig odling är lämpligt när du utvecklar nya eller förbättrade alger stammar eller utföra experiment som syftar till att förstå biologiska mekanismer. I dessa senare fall krävs en hög grad av experimentell kontroll att locka fram subtila förändringar i biologiska beteende. Därför krävs ofta axenic kulturer för att minimera de komplexa biotiska faktorer som förknippas med andra organismer (t.ex. bakterier, andra alger) som oundvikligen växer i stora utomhus-system. Även när man studerar interaktionen mellan alger och andra organismer, har vi funnit att användningen av mycket-kontrollerade försöksbetingelser är till hjälp när man undersöker molekylära utbyte mellan organismer^15,16,17.

Inom kategorin småskaliga inomhus Algodling, en uppsättning strategier har använts. Kanske är den vanligaste metoden att odla alger i Erlenmeyer-kolvar på ett skakbord under en ljus bank^18,19. Utbytet av syre och CO₂ sker genom passiv diffusion genom en skum plugg i toppen av kolven. Vissa forskare har förbättrat detta upplägg genom aktiv luftning av kolvar²⁰. En annan metod är att odla alger i flaskor, mixad av uppståndelse bar och aktiv luftning. Trots sin enkelhet, har vi funnit att användningen av kolvar och flaskor ofta leder till inkonsekventa resultat bland biologiska replikat. Förmodligen detta är på grund av position effekter – olika positioner får olika mängder av ljus, vilket även påverkar interna reaktorn temperaturer. Dagliga rotation av reaktorer till nya positioner kan hjälpa men inte lindra problemet eftersom vissa stadier av alger tillväxt (t.ex. tidigt exponentiell) är mer känsliga för positionella effekter än andra (t.ex. log fas).

På motsatta sidan av spektrumet av teknisk finess är fullt kontrollerade kommersiella photobioreactors. Dessa system kontinuerligt övervaka och justera villkoren i reaktorn att optimera algtillväxt. De har programmerbar belysning, realtid temperaturkontroll och pH-kontroll. Tyvärr, de är dyra och vanligtvis kosta flera tusen dollar per reaktor. Den vetenskapliga och tekniska tidskrifter kräver biologiska replikering av resultat, vilket kräver inköp av flera bioreaktorer. Vi presenterar här en bubbla reaktorn pelarsystem som överbryggar klyftan mellan det enkla (kolv) och sofistikerade (fullt kontrollerade bioreaktor) närmar sig för lab-skala alger odling. Bubbla kolumner Använd stigande gasbubblor att underlätta gasutbyte och blanda reaktorn. Detta tillvägagångssätt ger en viss kontroll över belysning och temperatur men gör det på ett sätt som är kostnadseffektivt. Dessutom har vi funnit detta system att ge konsekvent resultat bland biologiska replikat, minska antalet krävs för biologiska replikat som krävs för att få statistiskt signifikanta resultat jämfört med metoden kolv eller flaska. Vi har också använt detta system att framgångsrikt odla blandningar av alger och bakterier²¹. Utöver Algodling beskriva vi ett förfarande för att mäta den neutrala fetthalten i de odlade algerna. Den senare metoden har varit publicerad någon annanstans²², men vi inkludera den här proceduren för att ge anvisningar för hur man använder det framgångsrikt.

Protocol

1. inställning av bubbla kolumn Photobioreactors Konstruera en uppsättning ventilerade lock från de plast lock som kom med 1 L glasflaskor och hybridisering rör (se figur 1 för Schematisk och foton). Konstruera lock för luftfuktare, blanda fällan, varje air lift photobioreactor och varje flaska reaktor. ¼ ”hål i locket: 2 hål behövs för bioreaktor och luftfuktare lock; 3 hål behövs för blandande fällan. Glida en ¼ ”o-ringen över trådar av e…

Representative Results

Detta förfarande ger en tidsförloppet för alger optisk densitet data vid OD 550 nm (figur 4A). Den optiska densiteten och torr vikt koncentration data kan vara korrelerade (figur 4B). Detta åstadkoms genom att första beräkna den slutliga torrvikt alger koncentrationen efter frystorkning steget. Nästa, den optiska densiteten av kultur seriell utspädning (utförs den sista dagen för provtagning) och faktiska torrvikt halte…

Discussion

Viktigaste när odla alger är en förståelse för de särskilda behoven hos den organism eller grupp av organismer. Alger odling systemet beskrivs här kan användas till kultur ett brett utbud av alger men de särskilda abiotiska faktorerna (temperatur, media, pH, ljusintensitet, CO₂ -nivå, luftning rate) måste anpassas till behoven hos organismen. Observera de parametrar som beskrivs här användes för odling av Chlorella och Auxenochlorella. Dessa organismer är av industriellt intres…

Materials

Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles	Corning	16157-191	For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp	Home Depot	UC953A	or equivalent
1/4" female luer to barb	Nordson biomedical	Nordson FTLL360-6005	1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-244	50'
1/4" in O-rings	Grainger	1REC5	#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb	Nordson biomedical	FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-608	250'
1/8" male spinning luer to barb	Nordson biomedical	MLRL013-6005
1/8" multiport barb	Nordson biomedical	4PLL230-6005	1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb	Nordson biomedical	18230-6005	1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer	Nordson biomedical	Nordson MLRLB230-6005	1/8", PP
10 gallon fish tank	Walmart	802262	Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter	Dwyer	RMA-13-SSV	For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank	Agrobrite	FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-14-SSV	For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles	Corning	16157-136	For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-12-SSV	For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter	Dwyer	RMA-151-SSV	For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm	Whatman/ Fisher	09-745-1A	Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves	VWR	89094-714
Corning lids for pyrex bottles	VWR	89000-233	10 GL45 lids
Female luer endcap	Nordson biomedical	Nordson FTLLP-6005	Female stable PP
Hybridization tubes	Corning	32645-030	35×300 mm, pack of 2
Light timer	Walmart	556393626
Locknuts	Nordson biomedical	Nordson LNS-3	1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer	VWR	10153-690	Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap	Nordson biomedical	Nordson LP4-6005	Male plug PP
Spinning luer lock ring	Nordson biomedical	Nordson FSLLR-6005
Stir bars – long	VWR	58949-040	38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars – medium	VWR	58949-034	25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters	VWR	28145-491	13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes	Air-tite	89215-216	For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes	VWR	87003-294	Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes	Greiner Bio-One	82050-482	Sterile (or equivalent)
100 mm plates	VWR	25384-342	100×15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-276	Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips	Greiner Bio-One	82051-584	Sterile (or equivalent)
2 mL tubes	VWR	87003-298	Sterile (or equivalent)
50 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-348	Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate	Greiner Bio-One	89089-578	Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops	VWR	80094-478	Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator	Airgas	CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes	VWR	10158-556	Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates	Greiner Bio-One	82050-774	Polypropylene, flat bottom
Bleach	Walmart	550646751	Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform	BDH	BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol	BDH	BDH1133-1LP
Methanol	BDH	BDH20864.400
Nile red	VWR	TCN0659-5G
Pasteur pipette tips	VWR	14673-010
Sodium chloride	BDH	BDH9286-500G
Vegetable oil	Walmart	9276383	Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter)	Biospec products	11079105z
Equipment
Analytical balance	Mettler-Toledo	XS205DU	Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer	Omni	19-040E
Benchtop micro centrifuge	Thermo	Heraeus Fresco 21 with 24×2	Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater	VWR	75838-282	Including dry block for a microplate
Freeze dryer	Labconco	7670520	2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge	Thermo	Heraeus Megafuge 16R Tissue	Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer	VWR	10153-838