Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren und Bewertung von Krankheiten bei einem xenogenen Transplantat-versus-Host-Krankheitsmodell (XenoGVHD) vor. xenoGVHD bietet ein In-vivo-Modell zur Untersuchung der Immunsuppression menschlicher T-Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie man menschliche T-Zellen in Geweben mit digitaler PCR als Werkzeug zur Quantifizierung der Immunsuppression erkennt.

Abstract

Akute Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) ist eine signifikante Einschränkung für Patienten, die hämatopoetische Stammzelltransplantation als Therapie für hämatologische Mängel und Bösartige Nagenzen erhalten. Akute GVHD tritt auf, wenn Spender-T-Zellen Wirtgewebe als fremdes Antigen erkennen und eine Immunantwort auf den Wirt montieren. Aktuelle Behandlungen beinhalten toxische immunsuppressive Medikamente, die Patienten anfällig für Infektionen und Rezidiven machen. Daher gibt es laufende Forschung, um eine akute GVHD-Therapie zu bieten, die effektiv auf Spender-T-Zellen abzielen und Nebenwirkungen reduzieren kann. Ein Großteil dieser präklinischen Arbeit verwendet das xenogene GVHD (XenoGVHD) murinen Modell, das es ermöglicht, immunsuppressive Therapien an menschlichen Zellen zu testen, anstatt murine Zellen in einem In-vivo-System. Dieses Protokoll beschreibt, wie XenoGVHD induziert werden kann und wie man die klinische Bewertung blind und standardisiert, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll, wie digitale PCR verwendet werden, um menschliche T-Zellen in Mausgeweben zu erkennen, die anschließend zur Quantifizierung der Wirksamkeit getesteter Therapien verwendet werden können. Das xenoGVHD-Modell bietet nicht nur ein Modell zum Testen von GVHD-Therapien, sondern jede Therapie, die menschliche T-Zellen unterdrücken kann, die dann auf viele entzündliche Erkrankungen angewendet werden könnten.

Introduction

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist zu einer Routinebehandlung für Patienten geworden, die an hämatologischen Malignomen wie Leukämie mit schlechter Prognose leiden. Eine signifikante Komplikation von HSCT ist die akute Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GVHD). Eine Studie aus dem Jahr 2012 berichtete, dass akute syZUde GVHD bei 39 % der HSCT-Patienten, die Transplantationen von Geschwisterspendern erhielten, und 59 % der Patienten, die Transplantationen von nicht verwandten Spendern erhielten, entwickelt wurde¹. Akute GVHD tritt auf, wenn von Spendern abgeleitete T-Zellen die Organe des Empfängers angreifen. Die einzige erfolgreiche Therapie für GVHD ist die Behandlung mit hochimmunsuppressiven Medikamenten², die hochgiftig sind und das Risiko einer Infektion und Tumorwiederkehr erhöhen. So besteht trotz Verbesserungen, die in den letzten Jahren beim akuten GVHD-Überleben erzielt wurden^3,4,5, immer noch einen kritischen Bedarf an verbesserten GVHD-Therapien mit minimaler Toxizität, die eine langfristige Remission fördern.

Das übergeordnete Ziel der folgenden Methoden ist es, xenogene GVHD (XenoGVHD) zu induzieren und zu bewerten. Das XenoGVHD-Modell wurde als Werkzeug entwickelt, um akute GVHD mit menschlichen Zellen anstelle von murinen Zellen zu induzieren, was eine direktere Übersetzung der präklinischen GVHD-Forschung in klinische Studien^{ermöglicht 6}. Dieses Modell beinhaltet die intravenös injizierende menschliche periphere Mononuklezellen (PBMC) in NOD-SCID IL-2R-null (NSG)-Mäuse, die subletal bestrahlt werden. Injizierte menschliche T-Zellen werden durch menschliche Antigen-präsentierende Zellen (APCs) aktiviert, die murines Antigen darstellen, und die aktivierten T-Zellen wandern zu entfernten Geweben, was zu systemischen Entzündungen und letztlich zum Tod^{6,7, 8 , 9 , 10}. Krankheitspathologie und Progression im XenoGVHD-Modell imitieren die akute GVHD des Menschen. Insbesondere sind die pathogenen menschlichen T-Zellen reaktiv auf murinen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Proteine, die der T-Zell-Alloreaktivität in humanen GVHD^6,9ähneln. Der Hauptvorteil des XenoGVHD-Modells gegenüber dem MHC-Mismatch-Modell der Maus, dem anderen weit verbreiteten GVHD-Modell, ist, dass es das Testen von Therapien an menschlichen Zellen anstelle von murinen Zellen ermöglicht. Dies ermöglicht das Testen von Produkten, die direkt in die Klinik ohne Änderungen übersetzt werden können, weil sie auf menschliche Zellen ausgerichtet sind. Kürzlich wurde dieses Modell verwendet, um einen menschlichen Anti-IL-2-Antikörper¹¹, humane thymische regulatorische T-Zellen (Tregs)¹² und menschliche mesenchymale Stammzellen¹³ als mögliche Behandlungen für akute GVHD zu testen. In einem breiteren Kontext kann dieses Modell als In-vivo-Unterdrückungstest für jedes Medikament oder jeden Zelltyp verwendet werden, der die Aktivität menschlicher T-Zellen unterdrücken kann. Zum Beispiel, Stockis et al.¹⁴ verwendet das xenoGVHD Modell, um die Wirkung der Blockierung integrin 8 auf Treg Unterdrückungsaktivität in vivo zu untersuchen. So kann das xenoGVHD-Modell Einen Einblick in den Mechanismus jeder Therapie geben, die auf T-Zellen in einer In-vivo-Einstellung abzielt.

Eine weitere in diesem Protokoll beschriebene Methode ist die Erkennung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mithilfe der digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR). Das Ziel dieser Methode ist es, ein Werkzeug zur Quantifizierung der Migration und Proliferation von T-Zellen in Zielgeweben anzubieten, die die Wirksamkeit von immunsuppressiven Therapien messen, die in diesem Modell getestet werden. dPCR ist eine relativ neuartige Methode zur Quantifizierung von Nukleinsäuren¹⁵. Kurz gesagt, das PCR-Reaktionsgemisch ist in Partitionen unterteilt, die eine kleine Anzahl der Zielsequenz oder gar kein Ziel enthalten. Die Zielsequenz wird dann verstärkt und mit DNA-Interkalierenden Farbstoffen oder fluoreszierenden zielspezifischen Sonden nachgewiesen. dPCR quantifiziert die Anzahl der Kopien der Zielsequenz basierend auf dem Bruchteil der positiven Partitionen und Poissons Statistiken^15,16. Die Detektion von T-Zellen mit dPCR erfordert im Vergleich zu anderen alternativen Methoden, einschließlich Durchflusszytometrie und Histologie, viel weniger Gewebe und kann auf gefrorenem oder festem Gewebe durchgeführt werden. dPCR benötigt keine Standardkurve zur Ermittlung von Kopiernummern und auch keine technischen Replikationen. Dies reduziert die Menge an Reagenz und Vorlagen-DNA, die für dPCR benötigt wird, im Vergleich zu herkömmlichen quantitativen PCR (qPCR)¹⁶. Die Aufteilung der PCR-Reaktion in Subreaktionen in dPCR konzentriert effektiv die Ziele¹⁷. Somit ist dPCR in erster Linie ein Werkzeug zum Nachweis seltener Ziele in einer großen Menge an Nicht-Ziel-DNA. Zum Beispiel wird dPCR verwendet, um bakterielle Kontamination in Milch¹⁸zu erkennen, seltene Mutationen im Östrogenrezeptorgen¹⁹zu identifizieren und zirkulierende Tumor-DNA im Blut von Patienten zu erkennen²⁰. In diesem Protokoll dient dPCR als effizientes Werkzeug zur Detektion und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Geweben von Mäusen mit XenoGVHD.

Protocol

Alle Mausexperimente wurden in Übereinstimmung mit Zustimmung des University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt. Alle gesunden menschlichen Blutproben wurden mit informierter Zustimmung und mit Zustimmung des Institutional Review Board am University of Kansas Medical Center gewonnen. 1. Bestrahlung von NSG-Mäusen Einen Tag vor der PBMC-Injektion bestrahlen 8–12 Wochen alte NSG-Mäuse (entweder Geschlecht kann verwendet werden). In e…

Representative Results

Sublethal bestrahlte 8-12-Wochen alte NSG-Mäuse beiderlei Geschlechts, die menschliches PBMC erhielten, begannen mit der Anzeige klinischer Anzeichen von GVHD um Tag 10 nach der Injektion im Vergleich zu Negativkontrollmäusen, die nur PBS erhielten (Abbildung 1A). XenoGVHD-Mäuse hatten ein medianes Überleben von 23,5 Tagen (Abbildung1B). Mit digitaler PCR konnten CD3-Epsilon-positive menschliche T-Zellen in der Lunge und Lebe…

Discussion

Die Krankheitsprogression ist im XenoGVHD-Modell im Allgemeinen konsistent, selbst bei Injektion von PBMC von verschiedenen Spendern, so dass mehrere Experimente kombiniert werden können. Die wichtigsten Schritte, die erforderlich sind, um diese Konsistenz zu erhalten, sind die richtige i.v. Injektionstechnik, Blendung und konsistente Bewertung. Eine Studie von Nervi et al.²⁵ zeigte, dass im Vergleich zur intravenösen Schwanzveneninjektion retro-orbitale Injektionen von PBMC zu einer konsistente…

Materials

1.5 mL eppendorf tubes	Fisher	05-408-129
10 mL serological pipet	VWR International	89130-898
10mL BD Vacutainers – Green capped with Sodium Heparin	Becton Dickinson	366480
250 µL Ranin pipette tips	Rainin	17001118	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
50 mL conical tube	VWR International	89039-656
96-Well ddPCR plate	Bio-Rad	12001925
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Lonza	10-548E	Optional
Alcohol Wipes	Fisher Scientific	6818
Anesthesia Chamber	World Precision Instruments	EZ-178	Provided by animal facility
Anesthesia Machine	Parkland Scientific	PM1002	Provided by animal facility
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set	Becton Dickinson	367281
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864007
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O	Life Technologies	1811318
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll	Fisher Scientific	45001750
Insulin Syringe	Fisher Scientific	329424
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	Provided by animal facility
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mouse Irradiator Pie Cage	Braintree Scientific, Inc.	MPC 1	Holds up to 11 mice
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4")	Fisher Scientific	19-027-761
P1000 pipetman	MidSci	A-1000
P200 pipetman	MidSci	A-200
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040
Pipetaid Gilson Macroman	Fisher Scientific	F110756
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506
qPCR plates	VWR International	89218-292
QX200 Droplet Digital PCR System	Bio-Rad	12001925	Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen	Bio-Rad	1864006
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio-Rad	1864033
RNase and DNase-free plate seal	Thermo Scientific	12565491
RPMI Advanced 1640	Life Technologies	12633012
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply)	Fisher Scientific	67522
Sterile Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	21040CV
Sterile reservoir	VWR International	89094-662
Surgial Scissors	Kent Scientific	INS600393-4
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650914-4