Inducción y puntuación de la enfermedad de injerto-versus-huésped en un modelo de murina xenógeno y cuantificación de células T humanas en tejidos de ratón utilizando PCR digital
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para inducir y puntuar enfermedades en un modelo xenogénico de enfermedad de injerto contra huésped (xenoGVHD). xenoGVHD proporciona un modelo in vivo para estudiar la inmunosupresión de células T humanas. Además, describimos cómo detectar células T humanas en tejidos con PCR digital como herramienta para cuantificar la inmunosupresión.
Abstract
La enfermedad aguda de injerto contra huésped (EICH) es una limitación significativa para los pacientes que reciben trasplante de células madre hematopoyéticas como terapia para deficiencias hematológicas y neoplasias malignas. La EICH aguda ocurre cuando los células T del donante reconocen los tejidos huésped como un antígeno extraño y montan una respuesta inmune al huésped. Los tratamientos actuales implican medicamentos inmunosupresores tóxicos que hacen que los pacientes sean susceptibles a la infección y la recurrencia. Por lo tanto, hay investigaciones en curso para proporcionar una terapia aguda de la EICH que puede apuntar eficazmente a las células T del donante y reducir los efectos secundarios. Gran parte de este trabajo preclínico utiliza el modelo murino génico GVHD (xenoGVHD) que permite la prueba de terapias inmunosupresoras en células humanas en lugar de células murinas en un sistema in vivo. Este protocolo describe cómo inducir xenoGVHD y cómo cegar y estandarizar la puntuación clínica para garantizar resultados consistentes. Además, este protocolo describe cómo utilizar la PCR digital para detectar células T humanas en tejidos de ratón, que posteriormente se pueden utilizar para cuantificar la eficacia de las terapias probadas. El modelo xenoGVHD no sólo proporciona un modelo para probar las terapias de la EICH, sino cualquier terapia que pueda suprimir las células T humanas, que luego podrían aplicarse a muchas enfermedades inflamatorias.
Introduction
El trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) se ha convertido en tratamiento de rutina para pacientes que sufren de neoplasias malignas hematológicas como leucemia con mal pronóstico. Una complicación significativa del THCt es la enfermedad aguda de injerto contra huésped (EICH). Un estudio de 2012 informó que la EICH aguda se desarrolló en el 39% de los pacientes con HSCT que recibieron trasplantes de donantes hermanos y el 59% de los pacientes que recibieron trasplantes de donantes no relacionados1. La EICH aguda ocurre cuando las células T derivadas del donante atacan los órganos del receptor. La única terapia exitosa para la EICH esel tratamiento con fármacos altamente inmunosupresores 2, que son altamente tóxicos y aumentan el riesgo de infección y recurrencia tumoral. Así, a pesar de las mejoras que se han realizado en la supervivencia aguda de la EICH en los últimos años3,4,5, todavía existe una necesidad crítica de terapias mejoradas de la EICH con toxicidad mínima que promuevan la remisión a largo plazo.
El objetivo general de los siguientes métodos es inducir y puntuar la EICH xenogénica (xenoGVHD). El modelo xenoGVHD fue desarrollado como una herramienta para inducir la EICH aguda con células humanas enlugar de células murinas que permiten una traducción más directa de la investigación preclínica de la EICH a los ensayos clínicos 6. Este modelo consiste en inyectar por vía intravenosa células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en ratones NOD-SCID IL-2R-null (NSG) que se irradian subletalmente. Las células T humanas inyectadas son activadas por células que presentan antígeno humano (ACC) que presentan antígeno murno y las células T activadas migran a tejidos distantes resultando en inflamación sistémica y, en última instancia, muerte6,7, 8 , 9 , 10. La patología y progresión de la enfermedad en el modelo xenoGVHD imitan de cerca la EICH aguda humana. Específicamente, las células T humanas patógenas son reactivas a las principales proteínas del complejo de histocompatibilidad murina (MHC), que es similar a la aleactividad de las células T en la EICH6humana,9. La principal ventaja del modelo xenoGVHD sobre el modelo MHC-desajuste del ratón, el otro modelo GVHD ampliamente utilizado, es que permite la prueba de terapias en células humanas en lugar de células murinas. Esto permite probar productos que se pueden traducir directamente a la clínica sin ninguna modificación porque están hechos para apuntar a las células humanas. Recientemente, este modelo se ha utilizado para probar un anticuerpo humano anti-IL-211,células T reguladoras timmicas humanas (Tregs)12 y células madre mesenquimales humanas13 como tratamientos potenciales para la EICH aguda. En un contexto más amplio, este modelo se puede utilizar como un ensayo de supresión in vivo para cualquier droga o tipo de célula que pueda suprimir la actividad de las células T humanas. Por ejemplo,14 utilizaron el modelo xenoGVHD para estudiar el efecto del bloqueo de la integrina -V-8 en la actividad supresora de Treg in vivo. Por lo tanto, el modelo xenoGVHD puede proporcionar información sobre el mecanismo de cualquier terapia dirigida a los células T en un entorno in vivo.
Un método adicional descrito en este protocolo es cómo detectar células T humanas en tejidos de ratón utilizando reacción en cadena de polimerasa digital (dPCR). El objetivo de este método es ofrecer una herramienta para cuantificar la migración y proliferación de células T en los tejidos diana, que miden la eficacia de las terapias inmunosupresoras que se están probando en este modelo. dPCR es un método relativamente novedoso para la cuantificación de ácidos nucleicos15. Brevemente, la mezcla de reacción PCR se divide en particiones que contienen pequeños números de la secuencia de destino o ningún objetivo en absoluto. La secuencia de destino se amplifica y se detecta mediante colorantes intercaladores de ADN o sondas fluorescentes específicas del objetivo. dPCR cuantifica el número de copias de la secuencia de destino en función de la fracción de particiones positivas y las estadísticas de Poisson15,16. La detección de células T con dPCR requiere mucho menos tejido en comparación con otros métodos alternativos, como la citometría de flujo y la histología, y se puede realizar en tejido congelado o fijo. dPCR no requiere una curva estándar para determinar los números de copia, ni se requieren réplicas técnicas. Esto reduce la cantidad de ADN de reactivo y plantilla necesario para dPCR en comparación con el PCR cuantitativo tradicional (qPCR)16. La partición de la reacción pcR en subreacciones en dPCR concentra eficazmente los objetivos17. Por lo tanto, dPCR es principalmente una herramienta para la detección de objetivos raros en una gran cantidad de ADN no objetivo. Por ejemplo, el dPCR se utiliza para detectar la contaminación bacteriana en la leche18,identificar mutaciones raras en el gen del receptor de estrógeno19y detectar adn tumoral circulante en la sangre de los pacientes20. En este protocolo, dPCR sirve como una herramienta eficiente para detectar y cuantificar células T humanas en tejidos de ratones con xenoGVHD.
Protocol
Representative Results
Discussion
La progresión de la enfermedad es generalmente consistente en el modelo xenoGVHD, incluso con la inyección de PBMC de diferentes donantes, por lo que se pueden combinar múltiples experimentos. Los pasos clave necesarios para mantener esta consistencia son la técnica de inyección i.v. adecuada, cegadora y puntuación consistente. Un estudio realizado por Nervi et al.25 demostró que en comparación con la inyección intravenosa de vena de cola, las inyecciones retro-orbitales de PBMC dieron lu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer al laboratorio de Lane Christenson por proporcionar la máquina pcR digital utilizada en estos experimentos y por el soporte técnico proporcionado. También nos gustaría agradecer al Dr. Thomas Yankee por su orientación y tutoría. Estos estudios fueron apoyados por la Fundación De la Familia Tripp.
Materials
| 1.5 mL eppendorf tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 mL serological pipet | VWR International | 89130-898 | |
| 10mL BD Vacutainers – Green capped with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 366480 | |
| 250 µL Ranin pipette tips | Rainin | 17001118 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| 50 mL conical tube | VWR International | 89039-656 | |
| 96-Well ddPCR plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Optional |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 6818 | |
| Anesthesia Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | Provided by animal facility |
| Anesthesia Machine | Parkland Scientific | PM1002 | Provided by animal facility |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set | Becton Dickinson | 367281 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864007 | |
| DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O | Life Technologies | 1811318 | |
| Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | 45001750 | |
| Insulin Syringe | Fisher Scientific | 329424 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | Provided by animal facility |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mouse Irradiator Pie Cage | Braintree Scientific, Inc. | MPC 1 | Holds up to 11 mice |
| Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4") | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| P1000 pipetman | MidSci | A-1000 | |
| P200 pipetman | MidSci | A-200 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad | 1814040 | |
| Pipetaid Gilson Macroman | Fisher Scientific | F110756 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation |
| Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| qPCR plates | VWR International | 89218-292 | |
| QX200 Droplet Digital PCR System | Bio-Rad | 12001925 | Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications |
| QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| RNase and DNase-free plate seal | Thermo Scientific | 12565491 | |
| RPMI Advanced 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply) | Fisher Scientific | 67522 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 21040CV | |
| Sterile reservoir | VWR International | 89094-662 | |
| Surgial Scissors | Kent Scientific | INS600393-4 | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650914-4 |
Riferimenti
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