JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

Published: February 21, 2019
doi:
10.3791/59111
,
1Biozentrum,University of Basel

Summary

Golgi 세포 표면에서 단백질의 역행 수송 막 항상성 유지에 필수적 이다. 여기, 우리는 화학적 HeLa 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 재조합 단백질의 세포 표면에 골 교통을 분석 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

수송 단백질은 골을 넘어 셀 표면에서 막의 항상성, 세포 기관이 정체성과 생리학에 대 한 필수적입니다. 공부 하 고 퇴행 성 단백질 트래픽, 최근 고정 및 라이브 셀 이미징, 전자 현미경, 또는 화학적 여 골 복잡 한 세포 표면에서 수송 분석을 다양 한 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. 우리 설계 기능성된 안티 녹색 형광 단백질 (GFP) nanobodies-작고, 단위체, 높은 선호도 단백질 바인더-셀 라인 막 단백질 extracellular GFP moiety와 관심의 표현에 적용 될 수 있는. Derivatized nanobodies GFP 기자에 바인딩된 특별히 내 면 고 기자 정렬 경로 따라 피기백을 수송. Nanobodies은 기능성을 형광 현미경 검사 법에 의해 역행 수송을 따라 하는데 과산화 효소 2 전자에 의해 기자 nanobody 복합물의 ultrastructural 지역화를 조사 (APEX2)와 영상 살 fluorophores와 현미경 검사 법, 그리고 trans Golgi 네트워크 (TGN) 도착의 활동을 평가 하기 위해 티로신 sulfation (TS) 모티브. 이 방법론 문서에서는, 우리는 bacterially 표현 하 고 기능성된 nanobodies 정화 일반 절차 개요. 우리는 mCherry 및 TS 수정 nanobodies endocytic 통풍 관 및 TGN 도착 화물 단백질의 분석을 사용 하 여 우리의 도구를 사용 하 여를 강력한를 보여줍니다.

Introduction

단백질과 지질 세포 표면에서 다양 한 세포내 구획을의 역행 트래픽이 막 항상성 분 비를 균형 잡히게 하 고 참가자 전송 기계1 의 구성 요소를 재활용의 유지 보수에 대 한 중요 한 , 2. 다음 clathrin-또는-독립적인 endocytosis 통해 국제화, 단백질 및 지질 화물은 먼저 일찍 채울 endosomes 어디에서 그들은 더 중 엔 lysosomal 시스템, 플라즈마 막에 재활용 따라 리디렉션 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN) 대상. 다양 한 양이온 종속 및 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CDMPR 및 CIMPR) 등 참가자 막 횡단 화물 수용 체의 기능 사이클의 일부인는 TGN endosomes 및 셀 표면에서 재활용 제공 새로 합성 늦은 endosomes와 리소좀3,,45, sortilin 및 SorLA6,7, 및 Wntless (WLS) 수송 하는 세포 표면에 Wnt ligands는 TGN에서 lysosomal hydrolases 8 , 9 , 10 , 11. 다시는 TGN에 검색 하는 다른 단백질은 TGN46 및 그것의 관련된 isoforms12,13,14, SNAREs (수용 성 N-ethylmaleimide-민감한 퓨전 요소 첨부 수용 체) 15 , 16 , 17, 녹말 체 선구자 단백질 (APP)18,19, 진보적인 ankylosis (ANK) 단백질20, ATP7A/B 나 DMT121,22, 등 고 막 횡단 금속 전송기 효소 carboxypeptidase D, furin 또는 BACE123,,2425를 포함 하 여 처리. 이러한 내 생 단백질은 그렇다 하 고 박테리아 및 식물 독 소 (예를 들어, 시가 콜레라 독 소, 신은 abrin) 납치 cytosol26,27,에 retrotranslocation에 대 한 응급실에 도달 역행 수송 기계 , 2829.

직접 역행 트래픽 분석, 위해 이전 레이블 및 세포내 구획30화물 단백질을 세포 표면에서 따라 하는 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. Nanobodies는 homodimeric 무거운 체인만 항 체 (hcAbs) camelids과 연골 물고기31,32에서 자연스럽 게 발생 하는에서 파생 된 단백질 바인더의 새로운 가족을 나타냅니다. 그들은 hcAbs의 변수 중 체인 도메인 (VHH)를 구성 하 고 기존의 항 체 (예: IgGs)에 비해 많은 장점이 있다: 그들은 단위체, 작은 (~ 15 kDa), 높은 가용성, 이황화 결합, 없는 bacterially 표현 하 고 선정 수 높은 친 화력 바인딩33,,3435,36. 우리의 nanobody 도구를 다양 하 고 광범위 하 게 적용을 하려면 우리는 표면 레이블과 트랙 단백질 그들의 세포 외/lumenal 도메인에서 GFP 태그로 기능성된 안티-GFP nanobodies 고용. MCherry, 하는데 과산화 효소 2와 nanobodies (APEX2)의 기능화에 의해37또는 티로신 sulfation (TS) 시퀀스, 역행 bonafide 막 횡단 화물 단백질의 고정으로 분석 될 수 있다 수송과 라이브 셀 이미징 전자 현미경 검사 법, 또는 화학적. Tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 및 TPST2)에 의해 중재 티로신 sulfation 이기 때문에 trans Golgi 제한 posttranslational 수정/TGN, 우리 수 있다 직접 전송 하 고이 셀 표면에서 관심사의 단백질의 활동 세포내 Golgi 구획38,,3940.

이 방법 문서에서는, 우리는 포유류 세포30의 역행 교통 분석 응용 프로그램의 수에 적합 한 기능성된 nanobodies (VHH-2xTS,-APEX2,-mCherry 및 파생 상품)의 생산의 용이성을 설명 합니다. 우리는 주로 sulfation의 세포 표면에서 세포내 매매의 분석에 대 한 TS 사이트 수정 nanobody의 사용에 초점.

Protocol

1. 세균성 전이 기능성된 Nanobodies 참고: 이 프로토콜은 앞에서 설명한30식, 정화, 고 기능성된 안티-GFP nanobodies의 분석에 대 한 최적화 되었습니다. 다른 단백질 moieties와 derivatization이 표준 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다. 해 동 chemocompetent 박테리아 (~ 100 µ L) 단백질 표정에 적합 (예를 들면, 대장균 로제타 BL21 (DE3) 셀) 얼음에…

Representative Results

다양 한 세포내 목적지 역행 단백질 교통 조사, 우리는 최근 레이블 및 셀 표면30에서 재조합 융합 단백질을 따라 하는 안티-GFP nanobody 기반 도구를 설립 했습니다. 여기, 그러한 세균 생산 nanobodies derivatized 그리고 TGN 도착 sulfation 분석 조사를 그들의 사용 뿐만 아니라 형광 현미경 검사 법 및 immunoblotting, endocytic 통풍 관 공부를 그들의 응용 프로그램을 보?…

Discussion

Nanobodies 많은 이점이 기존의 항 체와 단백질 바인더 장비의 신흥 클래스 대표: 그들은 작은, 안정, 단위체, 높은 친 화력과 부족 이황화 채권33,35, 에 선정 될 수 있다 44 , 45. 세포 배양 시스템에 유기 체 개발 생물학46,47,48,<s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 그랜트 31003A-162643 스위스 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다. 우리 니콜 Beuret는 Biozentrum 이미징 핵심 시설 (IMCF) 지원에 대 한 감사합니다.

Materials

Anti-GFP antibody Sigma-Aldrich 118144600001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibody Bethyl Laboratories A190-114A
Anti-actin antibody EMD Millipore MAB1501
Goat anti-rabbit HRP Sigma-Aldrich A-0545
Goat anti-mouse HRP Sigma-Aldrich A-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 dissolved in 1 x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Applichem A3672
D-biotin Sigma-Aldrich B4501 dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride Sigma-Aldrich A3785 dissolved in sterile water
DNase I Applichem A3778 dissolved in sterile water
Lysozyme Sigma-Aldrich 18037059001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA) Sigma-Aldrich B5936
Puromycin Invivogen ant-pr-1
Penicillin/Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
L-glutamine Applichem A3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal calf serum (FCS) Biowest S181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfate Hartmann Analytics ARS0105 Product contains 5 mCi
Earle's balanced salts Sigma-Aldrich E6267
MEM amino acids (50 x) solution Sigma-Aldrich M5550
MEM vitamin solution (100 x) Sigma-Aldrich M6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836153001 Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Applichem A1008 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium salt Applichem A1491 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfate Applichem A1493 dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue) Sigma-Aldrich B-0149
Paraformaldehyde (PFA) Applichem A3813
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Ni Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5268-01
His GraviTrap columns GE Healthcare GE11-0033-99
His buffer kit GE Healthcare GE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columns GE Healthcare GE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well Bio-Rad 456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537
35-mm dishes Falcon 353001
6-well plates TPP 92406
Glass coverslips (No. 1.5H) VWR 631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Applichem A0999.0025 dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
Tryptone Applichem A1553
Yeast extract Applichem A1552
Magnesium chloride hexahydrate Merck Millipore 105833 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore 102382 dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chloride Merck Millipore 106404 dissolved in sterile water, stock is 5 M
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737 (2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer’s disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3′-phosphoadenosine 5′-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643 (2018).

Tags

NanobodyEndocytic UptakeRetrograde TransportTrans-Golgi NetworkCell Surface ReceptorsFluorescence MicroscopyElectron MicroscopyTyrosine Sulfation
check_url/it/59111?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (144), e59111, doi:10.3791/59111 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image