إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة من أنسجة الفئران القحفية والعظام غير الصائق
Summary
هنا، نقدم بروتوكول مفصل للكشف عن وقياس مستويات البروتين أثناء تكوين الجمجمة والوجه / مسببات الأمراض عن طريق التلطيخ المناعي باستخدام أنسجة الجمجمة والوجه الماوس كأمثلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نصف طريقة لإعداد واستئصال التبريد من الأنسجة الصلبة undecalcified من الفئران الشباب لتلطيخ المناعة.
Abstract
يوفر تلطيخ مناعة الأنسجة اكتشافًا محددًا للغاية وموثوقًا به للبروتينات ذات الأهمية داخل نسيج معين. هنا نقوم بوصف بروتوكول كامل وبسيط للكشف عن التعبير عن البروتين أثناء تكوين الجمجمة والوجه / مسببات الأمراض باستخدام أنسجة الجمجمة والوجه الماوس كأمثلة. ويتألف البروتوكول من إعداد الأنسجة وتشريحها بالتبريد بالتبريد، والفلورة المناعية غير المباشرة، والحصول على الصور، والقياس الكمي. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف طريقة لإعداد واستئصال الأنسجة الصلبة غير الصائرة للبقع المناعي، وذلك باستخدام أنسجة الوجه القحفي والعظام الطويلة كأمثلة. هذه الأساليب هي المفتاح لتحديد التعبير البروتين والتغيرات المورفولوجية / التشريحية في الأنسجة المختلفة أثناء تكوين الجمجمة والوجه / مسببات الأمراض. كما أنها تنطبق على الأنسجة الأخرى مع التعديلات المناسبة. المعرفة بالأنسجة وجودة عالية من الأقسام أمر بالغ الأهمية لاستخلاص النتائج العلمية من النتائج التجريبية. وتشمل القيود المحتملة لهذه المنهجية، على سبيل المثال لا الحصر، خصوصية الأجسام المضادة وصعوبات التحديد الكمي، التي تناقش هنا أيضاً.
Introduction
الوجه هو جزء رئيسي من الهوية البشرية، ويتكون من عدة أنواع مختلفة من الأنسجة، مثل ظهارة، العضلات، العظام، الغضروف، الأسنان. هذه الأنسجة مشتقة من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث: ectoderm، endoderm، وmesoderm1،2. لنمط وتطوير الأنسجة القحفية الوجهية بشكل صحيح، يجب أن يكون انتشار الخلايا والوفاة والتمايز منسقاً ومنظماً بشكل كبير من خلال مسارات إشارة محددة، مثل مسارات Wnt وFgf وHh وBMP3و4 ،5. العيوب في انتشار أو البقاء على قيد الحياة أو تمايز الخلايا سوف تؤدي إلى تشوهات في الوجه القحفي، والتي هي من بين العيوب الخلقية الخلقية الأكثر شيوعا. الفئران المعدلة وراثيا هي أدوات مفيدة لدراسة آليات تكوين الجمجمة والوجه ومسببات الأمراض1،2،3،4،5. فهم التغيرات في هياكل الجمجمة والوجه أثناء التنمية ومسببات الأمراض سيساعد على توضيح المبادئالتنموية الرئيسية وكذلك آليات تشوهات الوجه القحفي 1،2،3 ،4،5.
تلطيخ جبل كامل أو الأنسجة المقطعة مع الأجسام المضادة محددة هو تقنية لا تقدر بثمن لتحديد التوزيع المكاني للبروتينات ذات الأهمية 6. رسميا، يمكن أن تعتمد تلطيخ مناعة الأنسجة إما على الكيمياء المناعية (IHC) أو الفلورة المناعية (IF). بالمقارنة مع المنتج رد فعل مبهمة ولدت مع الركيزة كروموجينيك مثل 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) من قبل IHC, IF ينطوي على استخدام البوابات الفلورية مرئية من قبل المجهر الفلوري. لذلك، إذا IF قد تميز بوضوح الخلايا الإيجابية من الضوضاء الخلفية، ويسمح الصور لتحليلها كميا وتعزيزها بطريقة مباشرة من قبل برامج مثل ImageJ وأدوبي فوتوشوب7،8. يعمل نهج تلطيخ الجبل بأكمله على كتل صغيرة من الأنسجة (أقل من 5 مم سميكة)، والتي يمكن أن توفر معلومات ثلاثية الأبعاد حول موقع البروتينات / المستضدات دون الحاجة إلى إعادة الإعمار من الأقسام9و10 . ومع ذلك، بالمقارنة مع أقسام الأنسجة، جبل كامل تلطيخ المناعة يستغرق وقتا طويلا ويتطلب كميات كبيرة من حلول الأجسام المضادة. ليست جميع الأجسام المضادة متوافقة مع نهج جبل كامل الأساسية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاختراق غير الكامل للأجسام المضادة يؤدي إلى تلطيخ متفاوتة أو تلطيخ سلبي زائف. هنا سوف نركز على الكشف عن الفلورة المناعية من البروتينات / المستضدات على الأنسجة المقطعة. للأنسجة الصلبة (على سبيل المثال، الرأس، الأسنان، العظام الطويلة)، ترسب الكالسيوم أثناء التنمية / مسببات الأمراض يجعل العينة من الصعب قسم وشطف بسهولة قبالة خلال العلاج مناعة11،12. معظم البروتوكولات المتاحة حاليا الشارات الأنسجة الصلبة قبل التضمين لجعل القسم أسهل، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تدمر مورفولوجيا ومستضدات العينات إذا تم التعامل معها بشكل غير صحيح11،12. للتغلب على هذه القضايا، قمنا بتحسين نهج للتشريح بالتبريد للأنسجة الصلبة دون الشارات، مما أدى إلى تحسين التصور من مورفولوجيا وتوزيع البروتينات إشارة.
البروتوكول الموصوف هنا يستخدم لتحديد التغيرات المورفولومترية والأنسجة في أنسجة الوجه القحفي للفئران المعدلة وراثيا ً BMP. وعلى وجه التحديد، يتضمن البروتوكول (1) حصاد وتشريح أنسجة الرأس، (2) قسم وتلطيخ المناعة للعلامات التجريبية (Ki67، pSmad1/5/9) جنبا إلى جنب مع تلطيخ TUNEL، (3) تصوير الأقسام باستخدام المجهر الفلوري، وأخيرا (4) تحليل النتائج وقياسها كمياً. كما يرد وصف بروتوكول إعداد واستئصال الأنسجة الصلبة دون الشارات13. هذه الطرق هي الأمثل للأنسجة القحفية الوجه. كما أنها تنطبق على الأنسجة الأخرى من مختلف الأعمار من العينات مع التعديلات المناسبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم بروتوكول مفصل لإعداد رأس الماوس وأنسجة العظام غير الصائق، واستئصال التبريد لتلطيخ المناعة من انتشار الخلايا، وموت الخلايا، وعلامات إشارات BMP. كما نقوم بتفصيل استراتيجية الحصول على البيانات الكمية من الصور المناعية الفلورية. ويمكن أيضا أن تنطبق هذه الأساليب على الأنسجة الأخرى م?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (R01DE020843 إلى Y.M.)، والرابطة الدولية للموارد المالية، ومنحة في المعونة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31500788 إلى J.Y.).
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
Riferimenti
- Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
