Vævs præparation og immun farvning af mus craniofacial væv og Undecalcificeret knogle
Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til påvisning og kvantificering af protein niveauer under craniofacial morfogenesis/patogenesen ved immun farvning ved hjælp af mus craniofacial væv som eksempler. Derudover beskriver vi en metode til klargøring og kryoskæring af undecalcificeret hårdt væv fra unge mus til immun farvning.
Abstract
Vævs immun farvning giver meget specifik og pålidelig påvisning af proteiner af interesse inden for et givet væv. Her beskriver vi en komplet og enkel protokol til påvisning af protein ekspression under craniofacial morfogenesis/patogenese ved hjælp af mus kraniofacial væv som eksempler. Protokollen består af forberedelse og kryoskæring af væv, indirekte immunofluorescens, billed erhvervelse og kvantificering. Desuden beskrives en metode til klargøring og kryoskæring af undecalcificeret hårdt væv til immun farvning, ved hjælp af craniofacial væv og lange knogler som eksempler. Disse metoder er nøglen til at bestemme protein ekspression og morfologiske/anatomiske ændringer i forskellige væv under kraniofacial morfogenesis/patogenese. De gælder også for andre væv med passende ændringer. Viden om histologi og høj kvalitet af sektioner er afgørende for at drage videnskabelige konklusioner fra eksperimentelle resultater. De potentielle begrænsninger ved denne metode omfatter, men er ikke begrænset til, specificitet af antistoffer og kvantificerings vanskeligheder, som også drøftes her.
Introduction
Ansigtet er en vigtig del af menneskets identitet, og er sammensat af flere forskellige typer af væv, såsom epithelium, muskel, knogle, brusk, tand. Disse væv er afledt af alle tre kimlag: ectoderm, endoderm, og mesoderm1,2. For korrekt mønster og udvikling af craniofacial væv, celle spredning, død og differentiering skal være stærkt koordineret og reguleret af specifikke signalerings veje, såsom WNT, FGF, HH og BMP veje3,4 ,5. Defekter i spredning, overlevelse eller differentiering af celler vil føre til craniofacial misdannelser, som er blandt de hyppigst forekommende medfødte fødselsdefekter. Transgene mus er nyttige værktøjer til at studere mekanismer af craniofacial morfogenesis og patogenese1,2,3,4,5. Forståelse af ændringer i kraniofaciale strukturer under udvikling og patogenese vil bidrage til at afklare vigtige udviklingsmæssige principper samt mekanismerne i craniofacial misdannelser1,2,3 ,4,5.
Farvning af hele mount eller sektioneret væv med specifikke antistoffer er en uvurderlig teknik til bestemmelse af rumlig fordeling af proteiner af interesse 6. Formelt kan vævs immun farvning stole på enten immun histokemi (IHC) eller immunofluorescens (hvis). Sammenlignet med det uigennemsigtige reaktionsprodukt genereret med et kromogent substrat som 3, 3 ‘-Diaminobenzidin (DAB) af IHC, hvis det involverer brug af fluorescerende konjugater, der er synlige ved Fluorescens mikroskopi. Derfor, hvis kan tydeligt skelne positive celler fra baggrundsstøj, og tillader billeder, der skal analyseres kvantitativt og forbedret i en ligetil måde ved software som ImageJ og Adobe Photoshop7,8. Hele Mount farvnings metoden virker på små blokke af væv (mindre end 5 mm tyk), som kan give tredimensionelle oplysninger om placeringen af proteiner/antigener uden behov for genopbygning fra afsnit9,10 . Men sammenlignet med vævs sektioner er hele Mount immunofarvning tidskrævende og kræver store mængder af antistof opløsninger. Ikke alle antistoffer er kompatible med den grundlæggende hele monteringsmetode. Desuden vil den ufuldstændige indtrængen af antistoffer resultere i ujævn farvning eller falsk negativ farvning. Her vil vi fokusere på immunofluorescens påvisning af proteiner/antigener på sektionerede væv. For hårde væv (f. eks, hoved, tand, lang knogle), calcium deposition under udvikling/patogenesen gør prøven vanskeligt at afsnittet og let skylles ud under immun farvning behandling11,12. De fleste af de i øjeblikket tilgængelige protokoller Afkalk hårde væv før indlejring for at gøre skæring lettere, hvilket er tidskrævende og kan ødelægge morfologi og antigener af prøver, hvis håndteres forkert11,12. For at overvinde problemerne optimerede vi en tilgang til kryosectioning af hårde væv uden afkalkning, hvilket førte til forbedret visualisering af deres morfologi og distribution af signalerings proteiner.
Den her beskrevne protokol anvendes til at bestemme morphometriske og histologiske ændringer i det craniofaciale væv i BMP-Transgene mus. Specifikt, protokollen indeholder (1) høst og dissekere hoved væv, (2) sektion og immunofarvning af eksperimentelle markører (Ki67, pSmad1/5/9) sammen med Tunel farvning, (3) Imaging afsnittene ved hjælp fluorescens mikroskop, og endelig (4) analyse og kvantificering af resultaterne. Protokollen til forberedelse og kryosektions hårde væv uden afkalkning er også beskrevet13. Disse metoder er optimeret til craniofacial væv. De gælder også for andre væv fra forskellige aldre af prøver med passende ændringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her giver vi en detaljeret protokol til fremstilling af muse hoved og undecalcified knogle væv, og kryosectioning for immun farvning af celle spredning, celledød, og BMP signalering markører. Vi har også detaljeret strategi for opnåelse af kvantitative data fra immunfluorescent billeder. Disse metoder kan også anvendes på andre væv med passende ændringer.
Betingelser for vævs præparation varierer afhængigt af vævets størrelse og type. Fiksering og kryoprotection tid normalt brug …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01DE020843 til Y.M.), den internationale FOP Association (Y.M.), og en tilskud-i-støtte fra National Natural Science Foundation i Kina (31500788 til J.Y.).
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
Riferimenti
- Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
