ऊतक तैयारी और माउस Craniofacial ऊतकों और undecalified हड्डी के इम्यूनोस्टेनिंग
Summary
यहाँ, हम उदाहरण के रूप में माउस craniofacial ऊतकों का उपयोग करके craniofacial morphogenesis/pathogenesis के दौरान प्रोटीन के स्तर का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, हम प्रतिरक्षा के लिए युवा चूहों से undecalified कठोर ऊतकों की तैयारी और cryosectioning के लिए एक विधि का वर्णन.
Abstract
ऊतक इम्यूनोस्टेनिंग किसी दिए गए ऊतक के भीतर ब्याज के प्रोटीन का अत्यधिक विशिष्ट और विश्वसनीय पता लगाने प्रदान करता है। यहाँ हम उदाहरण के रूप में माउस craniofacial ऊतकों का उपयोग craniofacial morphogenesis/pathogenesis के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक पूर्ण और सरल प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रोटोकॉल की तैयारी और ऊतकों के cryosectioning के होते हैं, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस, छवि अधिग्रहण, और परिमाणीकरण. इसके अलावा, इम्यूनोस्टेनिंग के लिए undecalified कठोर ऊतकों की तैयारी और क्रायोसेक्शनिंग के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है, उदाहरण के रूप में craniofacial ऊतकों और लंबी हड्डियों का उपयोग कर। उन विधियों को प्रोटीन अभिव्यक्ति और craniofacial morphogenesis/pathogenesis के दौरान विभिन्न ऊतकों में आकृतिक /परमाणु परिवर्तन निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे भी उचित संशोधनों के साथ अन्य ऊतकों के लिए लागू होते हैं. ऊतक विज्ञान और वर्गों के उच्च गुणवत्ता का ज्ञान प्रयोगात्मक परिणामों से वैज्ञानिक निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इस पद्धति की संभावित सीमाओं में शामिल हैं, लेकिन एंटीबॉडी की विशिष्टता और परिमाणीकरण की कठिनाइयों तक ही सीमित नहीं हैं, जिन पर यहां भी चर्चा की गई है।
Introduction
चेहरा मानव पहचान का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, और इस तरह के उपकला, मांसपेशियों, हड्डी, उपास्थि, दांत के रूप में ऊतकों के कई अलग अलग प्रकार से बना है। वे ऊतक सभी तीन रोगाणु परतों से प्राप्त होते हैं: बहिर्चर्म, अंत:चर्म, तथा मध्यजनस्तर1,2. उचित पैटर्न और craniofacial ऊतकों के विकास के लिए, सेल प्रसार, मौत और भेदभाव अत्यधिक समन्वित और विशिष्ट संकेतन रास्ते द्वारा विनियमित होने की जरूरत है, जैसे Wnt, Fgf, Hh और Bmp रास्ते3,4 ,5. कोशिकाओं के प्रसार, अस्तित्व या भेदभाव में दोष craniofacial विकृतियों के लिए नेतृत्व करेंगे, जो सबसे अक्सर होने वाली जन्मजात जन्म दोष के बीच में हैं. ट्रांसजेनिक चूहे कपालीय रूपजनन तथा रोगजनन1,2,3,4,5के तंत्र ों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी साधन हैं . विकास और रोगजनन के दौरान कपालीय संरचनाओं में परिवर्तन को समझना महत्वपूर्ण विकासात्मक सिद्धांतों के साथ-साथ कपालात्मक विकृतियोंकेतंत्र को स्पष्ट करने में मदद करेगा1 ,2,3 ,4,5.
विशिष्ट एंटीबॉडी वाले पूरे माउंट या अनुभागीय ऊतकों का दाग ब्याज 6के प्रोटीन के स्थानिक वितरण का निर्धारण करने के लिए एक अमूल्य तकनीक है . औपचारिक रूप से, ऊतक इम्यूनोस्टेनिंग या तो इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) या इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) पर भरोसा कर सकते हैं। IHC द्वारा 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) के रूप में एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट के साथ उत्पन्न अपारदर्शी प्रतिक्रिया उत्पाद के साथ तुलना में, यदि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई फ्लोरोसेंट संयुग्मी का उपयोग शामिल है। इसलिए, IF स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि शोर से सकारात्मक कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं, और छवियों मात्रात्मक विश्लेषण किया जा करने के लिए अनुमति देता है और इस तरह ImageJ और एडोब फोटोशॉप7,8के रूप में सॉफ्टवेयर द्वारा एक सरल फैशन में बढ़ाया. पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण ऊतक के छोटे ब्लॉकों पर काम करता है (कम से कम 5 मिमी मोटी), जो वर्गों9से पुनर्निर्माण के लिए आवश्यकता के बिना प्रोटीन के स्थान के बारे में तीन आयामी जानकारी प्रदान कर सकते हैं/ . हालांकि, ऊतक वर्गों के साथ तुलना में, पूरे माउंट इम्यूनोस्टेनिंग समय लेने वाला है और एंटीबॉडी समाधान की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है। नहीं सभी एंटीबॉडी बुनियादी पूरे माउंट दृष्टिकोण के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा, एंटीबॉडी के अपूर्ण प्रवेश असमान धुंधला या झूठी नकारात्मक धुंधला में परिणाम होगा. यहाँ हम अनुभागीय ऊतकों पर प्रोटीन/एंटीजन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित करेंगे। कठोर ऊतकों (जैसे, सिर, दांत, लंबी हड्डी) के लिए, विकास/रोगजनकता के दौरान कैल्शियम जमा करने से नमूना को अनुभाग में मुश्किल हो जाता है और इम्यूनोस्टेनिंग उपचार11,12 केदौरान आसानी से कुल्ला किया जाता है। वर्तमान में उपलब्ध अधिकांश प्रोटोकॉल अनुभागीकरण को आसान बनाने के लिए एम्बेड करने से पहले कठोर ऊतकों को निष्क्रिय कर देते हैं, जो समय लगता है और यदि गलत तरीके से 11,12को संभाला जाए तो नमूनों की आकृति विज्ञान और प्रतिजनों को नष्ट कर सकता है. मुद्दों पर काबू पाने के लिए, हम decalification के बिना कठिन ऊतकों के cryosectioning के लिए एक दृष्टिकोण अनुकूलित, उनकी आकृति विज्ञान और संकेत प्रोटीन के वितरण के बेहतर दृश्य के लिए अग्रणी.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल बीएमपी ट्रांसजेनिक चूहों के craniofacial ऊतकों में morphometric और हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. विशेष रूप से, प्रोटोकॉल में शामिल हैं (1) कटाई और विच्छेदन सिर के ऊतकों, (2) अनुभाग और प्रयोगात्मक मार्करों के इम्यूनोस्टेनिंग (Ki67, pSmad1/5/9) TUNEL धुंधला के साथ, (3) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग वर्गों इमेजिंग, और अंत में (4) विश्लेषण और परिणामों की मात्रा निर्धारित. बिना गणना के कठोर ऊतकों को तैयार करने और क्रायोसेक्शन के प्रोटोकॉल का भीवर्णन 13है . उन तरीकों craniofacial ऊतकों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. वे भी उचित संशोधनों के साथ नमूनों की विभिन्न उम्र से अन्य ऊतकों के लिए लागू होते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम माउस सिर और undecalified हड्डी के ऊतकों की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और सेल प्रसार, सेल मौत, और BMP संकेत मार्करों के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए cryosectioning. हम भी इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियों …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01DE020843 से Y.M.), अंतर्राष्ट्रीय FOP एसोसिएशन (Y.M.) द्वारा समर्थित किया गया था, और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31500788 से J.Y.) से सहायता अनुदान.
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
Riferimenti
- Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
