Preparazione dei tessuti e immunostaining dei tessuti craniofacciali del topo e dell'osso non decalcolato
Summary
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare e quantificare i livelli di proteine durante la morfogenesi/patogenesi craniofacciale immunostaining usando come esempi i tessuti craniofacciali dei topi. Inoltre, descriviamo un metodo per la preparazione e la criosezione dei tessuti duri non decalcolati dai giovani topi per l’immunostaining.
Abstract
L’immunostaining dei tessuti fornisce un rilevamento altamente specifico e affidabile delle proteine di interesse all’interno di un determinato tessuto. Qui descriviamo un protocollo completo e semplice per rilevare l’espressione proteica durante la morfogenesi/patogenesi craniofacciale usando come esempi i tessuti craniofacciali dei topi. Il protocollo consiste nella preparazione e criosezione dei tessuti, nell’immunofluorescenza indiretta, nell’acquisizione di immagini e nella quantificazione. Inoltre, viene descritto un metodo per la preparazione e la criosezione dei tessuti duri non decalcolati per l’immunostaining, usando come esempi tessuti craniofacciali e ossa lunghe. Questi metodi sono fondamentali per determinare l’espressione proteica e i cambiamenti morfologici/anatomici in vari tessuti durante la morfogenesi craniofacciale/patogenesi. Sono applicabili anche ad altri tessuti con modifiche appropriate. La conoscenza dell’istologia e dell’alta qualità delle sezioni è fondamentale per trarre conclusioni scientifiche da risultati sperimentali. Le potenziali limitazioni di questa metodologia includono, ma non si limitano alla specificità degli anticorpi e alle difficoltà di quantificazione, che sono discusse anche qui.
Introduction
Il viso è una parte fondamentale dell’identità umana ed è composto da diversi tipi di tessuti, come epitelio, muscoli, ossa, cartilagine, denti. Tali tessuti derivano da tutti e tre gli strati germinali: ectoderma, endoderma e mesoderma1,2. Per un corretto modello e lo sviluppo di tessuti craniofacciali, la proliferazione cellulare, la morte e la differenziazione devono essere altamente coordinati e regolati da percorsi di segnalazione specifici, come wnt, Fgf, Hh e Bmp percorsi3,4 ,5. Difetti nella proliferazione, nella sopravvivenza o nella differenziazione delle cellule porteranno a malformazioni craniofacciali, che sono tra i difetti congeniti di nascita congeniti più frequenti. I topi transgenici sono strumenti utili per studiare i meccanismi della morfogenesi craniofacciale e della patogenesi1,2,3,4,5. Comprendere i cambiamenti nelle strutture craniofacciali durante lo sviluppo e la patogenesi aiuterà a chiarire i principi chiave dello sviluppo e i meccanismi delle malformazioni craniofacciali1,2,3 ,4,5.
La colorazione di tessuti interi montati o sezionato con anticorpi specifici è una tecnica inestimabile per determinare la distribuzione spaziale delle proteine di interesse 6. Formalmente, l’immunostaining tissutale può basarsi sull’immunosofia (IHC) o sull’immunofluorescenza (IF). Rispetto al prodotto di reazione opaco generato con un substrato cromogenico come 3,3′-Diaminobenzidina (DAB) dall’IHC, IF comporta l’uso di coniugati fluorescenti visibili dalla microscopia a fluorescenza. Pertanto, IF può distinguere chiaramente le cellule positive dal rumore di fondo e consente alle immagini di essere analizzate quantitativamente e migliorate in modo semplice da software come ImageJ e Adobe Photoshop7,8. L’intero approccio di colorazione del supporto funziona su piccoli blocchi di tessuto (meno di 5 mm di spessore), che possono fornire informazioni tridimensionali sulla posizione di proteine / antigeni senza la necessità di ricostruzione dalle sezioni9,10 . Tuttavia, rispetto alle sezioni tissutali, l’immunostaining di montaggio completo richiede molto tempo e richiede grandi volumi di soluzioni anticorpali. Non tutti gli anticorpi sono compatibili con l’approccio di base di montaggio completo. Inoltre, la penetrazione incompleta degli anticorpi comporterà macchie irregolari o macchie false negative. Qui ci concentreremo sul rilevamento dell’immunofluorescenza di proteine/antigeni sui tessuti sezionato. Per i tessuti duri (ad esempio, testa, dente, osso lungo), la deposizione di calcio durante lo sviluppo/patogenesi rende il campione difficile da sezionere e facilmente sciacquato durante il trattamento immunostaining11,12. La maggior parte dei protocolli attualmente disponibili decalcificano i tessuti duri prima dell’incorporamento per rendere più facile la sezionamento, che richiede molto tempo e può distruggere morfologia e antigeni di campioni se gestiti in modo improprio11,12. Per superare i problemi, abbiamo ottimizzato un approccio per la criosezione dei tessuti duri senza decalcificazione, portando a una migliore visualizzazione della loro morfologia e distribuzione delle proteine di segnalazione.
Il protocollo qui descritto viene utilizzato per determinare i cambiamenti morfometrici e istologici nei tessuti craniofacciali dei topi transgenici BMP. In particolare, il protocollo comprende (1) la raccolta e la dissezione dei tessuti della testa, (2) la sezione e l’immunostaining dei marcatori sperimentali (Ki67, pSmad1/5/9) insieme alla colorazione TUNEL, (3) l’imaging delle sezioni utilizzando il microscopio a fluorescenza e infine (4) l’analisi e la quantificazione dei risultati. Il protocollo per preparare e criosezione tessuti duri senza decalcificazione è anche descritto13. Questi metodi sono ottimizzati per i tessuti craniofacciali. Sono applicabili anche ad altri tessuti di varie età di campioni con modifiche appropriate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione della testa del topo e dei tessuti ossei non decalcoldatificati, e la criosezione per l’immunostaining della proliferazione cellulare, della morte cellulare e dei marcatori di segnalazione BMP. Inoltre, indettagliamo la strategia per ottenere dati quantitativi dalle immagini immunofluorescenti. Tali metodi possono essere applicabili anche ad altri tessuti con modifiche appropriate.
Le condizioni per la preparazione dei tessuti variano …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (da R01DE020843 a Y.M.), dall’International FOP Association (Y.M.) e da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (da 31500788 a J.Y.).
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
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