Preparo tecidual e imunocoloração de tecidos craniofaciais do camundongo e osso não-descalcificado
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para detectar e quantificar níveis da proteína durante a morfogênese/patogénese craniofacial pela imunocoloração usando tecidos craniofacial do rato como exemplos. Além, nós descrevemos um método para a preparação e o criossecção de tecidos duros secçóes dos ratos novos para a imunocoloração.
Abstract
A imunocoloração tecidual fornece detecção altamente específica e confiável de proteínas de interesse dentro de um determinado tecido. Aqui nós descrevemos um protocolo completo e simples para detectar a expressão da proteína durante a morfogênese/patogénese craniofacial usando tecidos craniofacial do rato como exemplos. O protocolo consiste na preparação e criseccionamento de tecidos, imunofluorescência indireta, aquisição de imagem e quantificação. Além, um método para a preparação e criossecção de tecidos duros secçóes para a imunocoloração é descrito, usando os tecidos craniofacial e os ossos longos como exemplos. Esses métodos são fundamentais para determinar a expressão protéica e as alterações morfológicas/anatômicas em vários tecidos durante a morfogênese/patogênese craniofacial. Eles também são aplicáveis a outros tecidos com modificações apropriadas. O conhecimento da histologia e da alta qualidade das seções é crítico para extrair conclusões científicas dos resultados experimentais. As potenciais limitações desta metodologia incluem, mas não se limitam à especificidade dos anticorpos e dificuldades de quantificação, que também são discutidas aqui.
Introduction
O rosto é uma parte fundamental da identidade humana, e é composto de vários tipos diferentes de tecidos, tais como epitélio, músculo, osso, cartilagem, dente. Esses tecidos são derivados de todas as três camadas germinativas: ectoderma, endoderma e mesoderma1,2. Para padronização adequada e desenvolvimento de tecidos craniofaciais, proliferação celular, morte e diferenciação precisam ser altamente coordenados e regulados por vias de sinalização específicas, tais como WNT, FGF, hh e BMP vias3,4 ,5. Os defeitos na proliferação, na sobrevivência ou na diferenciação das pilhas conduzirão às malformações craniofacial, que estão entre os defeitos congénitos os mais freqüentemente de ocorrência. Camundongos transgênicos são ferramentas úteis para estudar mecanismos de morfogênese craniofacial e patogênese1,2,3,4,5. Compreender as mudanças nas estruturas craniofacial durante o desenvolvimento e a patogénese ajudarão a esclarecer princípios de desenvolvimento chaves assim como os mecanismos de malformações craniofacial1,2,3 ,4,5.
A coloração da montagem inteira ou dos tecidos seccionados com anticorpos específicos é uma técnica inestimável para determinar a distribuição espacial das proteínas de interesse 6. Formalmente, a imunocoloração tecidual pode depender tanto da imunohistoquímica (IHC) quanto da imunofluorescência (IF). Comparado com o produto opaco da reação gerado com um substrato cromogênico tal como 3, 3 ‘-Diaminobenzidine (DAB) por IHC, se envolve o uso de conjugados fluorescentes visíveis pela microscopia de fluorescência. Portanto, se pode diferenciar claramente as células positivas do ruído de fundo, e permite que as imagens sejam analisadas quantitativamente e melhoradas de forma simples por software como o ImageJ e o Adobe Photoshop7,8. Toda a abordagem de coloração de montagem funciona em pequenos blocos de tecido (menos de 5 mm de espessura), que podem fornecer informações tridimensionais sobre a localização de proteínas/antígenos sem a necessidade de reconstrução das secções9,10 . Entretanto, comparado com as seções do tecido, a imunomarcação inteira da montagem é demorada e exige grandes volumes de soluções do anticorpo. Nem todos os anticorpos são compatíveis com a abordagem básica de montagem inteira. Além disso, a penetração incompleta de anticorpos resultará em coloração irregular ou coloração negativa falsa. Aqui nós focaremos na deteção da imunofluorescência das proteínas/antígenos em tecidos seccionados. Para os tecidos duros (por exemplo, cabeça, dente, osso longo), o depósito do cálcio durante o desenvolvimento/patogénese faz a amostra difícil à seção e enxaguado facilmente fora durante o tratamento da imunomarcação11,12. A maioria dos protocolos atualmente disponíveis descalcificam os tecidos duros antes da incorporação para facilitar a seccionamento, o que consome tempo e pode destruir a morfologia e os antígenos das amostras se manuseados de forma inadequada11,12. Para superar as questões, otimizamos uma abordagem de critilização de tecidos duros sem descalcificação, levando a uma melhor visualização de sua morfologia e distribuição de proteínas de sinalização.
O protocolo aqui descrito está sendo utilizado para determinar alterações morfométricas e histológicas nos tecidos craniofaciais de camundongos transgênicos BMP. Especificamente, o protocolo inclui (1) colheita e dissecação dos tecidos da cabeça, (2) seção e imunocoloração de marcadores experimentais (pSmad1/5/9), juntamente com a coloração de TUNEL, (3) imagens das seções utilizando microscópio de fluorescência e, finalmente (4) analisando e quantificando os resultados. O protocolo para preparar e os tecidos duros do criossecção sem descalcificação é descrito igualmente13. Esses métodos são otimizados para os tecidos craniofaciais. Eles também são aplicáveis a outros tecidos de várias idades de amostras com modificações apropriadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a preparação da cabeça do rato e dos tecidos secçóes do osso, e criossecção para a imunomarcação da proliferação de pilha, da morte da pilha, e dos marcadores de sinalização do BMP. Também detalham a estratégia de obtenção de dados quantitativos de imagens imunofluorescentes. Esses métodos também podem ser aplicáveis a outros tecidos com modificações apropriadas.
As condições para a preparação dos tecidos variam consoan…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (R01DE020843 a Y.M.), a Associação Internacional FOP (Y.M.), e um subsídio de ajuda da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31500788 a J.Y.).
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
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