Vävnads beredning och immunofärgning av mus kraniofaciala vävnader och Undecalcified Bone
Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att upptäcka och kvantifiera proteinnivåer under kraniofacial morfogenes/patogenes genom immunofärgning med hjälp av mus kraniofacial vävnader som exempel. Dessutom beskriver vi en metod för beredning och kryosektionering av undecalcified hårda vävnader från unga möss för immunofärgning.
Abstract
Vävnads immunofärgning ger mycket specifik och tillförlitlig detektion av proteiner av intresse inom en given vävnad. Här beskriver vi ett komplett och enkelt protokoll för att detektera proteinuttryck under kraniofacial morfogenes/patogenes med hjälp av mus kraniofacial vävnader som exempel. Protokollet består av beredning och kryosektionering av vävnader, indirekt immunofluorescens, bild förvärv och kvantifiering. Dessutom beskrivs en metod för beredning och kryosektionering av undecalcified hård vävnad för immunofärgning, med hjälp av kraniofaciala vävnader och långa ben som exempel. Dessa metoder är avgörande för att bestämma proteinuttryck och morfologiska/anatomiska förändringar i olika vävnader under kraniofacial morfogenes/patogenes. De är också tillämpliga på andra vävnader med lämpliga modifieringar. Kunskap om histologi och hög kvalitet på sektioner är avgörande för att dra vetenskapliga slutsatser från experimentella resultat. Potentiella begränsningar av denna metod inkluderar men är inte begränsade till specificitet av antikroppar och kvantifieringsproblem, som också diskuteras här.
Introduction
Ansiktet är en viktig del av människans identitet, och består av flera olika typer av vävnader, såsom epitel, muskler, ben, brosk, tand. Dessa vävnader härstammar från alla tre bakterie lagren: ektoderm, endoderm och mesoderm1,2. För korrekt mönkning och utveckling av kraniofaciala vävnader, cellproliferation, död och differentiering måste vara mycket samordnade och regleras av specifika signalering vägar, såsom WNT, FGF, hh och BMP vägar3,4 ,5. Defekter i proliferation, överlevnad eller differentiering av celler kommer att leda till kraniofaciala missbildningar, som är bland de vanligast förekommande medfödda missbildningar. Transgena möss är användbara verktyg för att studera mekanismerna för kraniofacial morfogenes och patogenes1,2,3,4,5. Att förstå förändringarna i kraniofaciala strukturer under utveckling och patogenes kommer att bidra till att klargöra viktiga utvecklingsprinciper samt mekanismerna för kraniofaciala missbildningar1,2,3 ,4,5.
Färgning av hela Mount eller sektionerade vävnader med specifika antikroppar är en ovärderlig teknik för bestämning av rumslig distribution av proteiner av intresse 6. Formellt kan vävnads immunofärgning förlita sig antingen på immunohistokemi (IHC) eller immunofluorescens (IF). Jämfört med den ogenomskinliga reaktionsprodukt som genereras med ett kromogent substrat såsom 3, 3 ‘-Diaminobenzidin (DAB) av IHC, om det innebär användning av fluorescerande konjugat synligt genom fluorescens mikroskopi. Därför, om kan tydligt skilja positiva celler från bakgrundsbrus, och gör att bilder kan kvantitativt analyseras och förbättras på ett enkelt sätt av program som imagej och Adobe Photoshop7,8. Hela monteringen färgning tillvägagångssätt fungerar på små block av vävnad (mindre än 5 mm tjock), som kan ge tredimensionell information om placeringen av proteiner/antigener utan behov av rekonstruktion från avsnitt9,10 . Jämfört med vävnads sektioner är dock hela Mount immunofärgning tidskrävande och kräver stora mängder antikropps lösningar. Alla antikroppar är inte kompatibla med det grundläggande hela monterings sättet. Dessutom kommer den ofullständiga penetrationen av antikroppar resultera i ojämn färgning eller falsk negativ färgning. Här kommer vi att fokusera på immunofluorescensen detektion av proteiner/antigener på sektionerade vävnader. För hårda vävnader (t. ex, huvud, tand, långa ben), kalcium deposition under utveckling/patogenes gör provet svårt att avsnitt och lätt sköljas av under immunofärgning behandling11,12. De flesta av de för närvarande tillgängliga protokollen avkalka hårda vävnader innan inbäddning för att göra snittning lättare, vilket är tidskrävande och kan förstöra morfologi och antigener av prover om de hanteras felaktigt11,12. För att övervinna problemen, vi optimerat ett tillvägagångssätt för kryosektionering av hårda vävnader utan avalskning, vilket leder till förbättrad visualisering av deras morfologi och distribution av signalering proteiner.
Det protokoll som beskrivs här används för att bestämma morphometriska och histologiska förändringar i kraniofaciala vävnader av BMP transgena möss. Specifikt innehåller protokollet (1) skörd och dissekera huvud vävnader, (2) avsnitt och immunofärgning av experimentella markörer (Ki67, pSmad1/5/9) tillsammans med TUNEL färgning, (3) Imaging sektionerna med fluorescensmikroskop, och slutligen (4) analysera och kvantifiera resultaten. Protokollet för beredning och kryosektion av hårda vävnader utan avalskning beskrivs också13. Dessa metoder är optimerade för kraniofacial vävnader. De är också tillämpliga på andra vävnader från olika åldrar av prover med lämpliga modifieringar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här ger vi ett detaljerat protokoll för beredning av mus huvudet och undecalcified ben vävnader, och kryosektionering för immunofärgning av cellproliferation, celldöd, och BMP signal markörer. Vi specificerar också strategin för att erhålla kvantitativa data från Immunofluorescerande bilder. Dessa metoder kan också tillämpas på andra vävnader med lämpliga modifieringar.
Villkoren för vävnads beredning varierar beroende på vävnadernas storlek och typ. Fixeringen och kryoskyd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01DE020843 till Y.M.), International FOP Association (Y.M.), och en bidrag-in-Aid från National Natural Science Foundation i Kina (31500788 till J.Y.).
Materials
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
Riferimenti
- Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
- Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
- Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
- Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
- Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
- Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
- Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
- Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
- González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
- Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
- Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
- Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
- Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
- Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
- Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).
