Wholemount i Situ hybridisering til Astyanax embryoner
Summary
Denne protokol giver mulighed for visualisering af genekspression i embryonale Astyanax cavefish. Denne fremgangsmåde er blevet udviklet med formålet at maksimere gen expression signal, samtidig minimere uspecifikke baggrund farvning.
Abstract
I de seneste år, er et udkast til genom for den blinde mexicanske cavefish (Astyanax mexicanus) blevet frigivet, afslørende sekvens identiteter for tusindvis af gener. Tidligere forskning i denne nye modelsystem kapitaliseres på omfattende genome-wide undersøgelser, der har identificeret talrige kvantitative træk loci (QTL) forbundet med forskellige cave-associerede fænotyper. Evnen til at forbinde gener af interesse til den arvelige basis for fænotypisk ændring er dog en betydelig udfordring. En teknik, der kan lette dybere forståelse af rollen, som udviklingen i troglomorphic evolution er hele-mount in situ hybridisering. Denne teknik kan gennemføres for at direkte sammenligne genekspression mellem hule og flade bolig former, nominere kandidat gener underliggende etablerede QTL, identificere gener af interesse fra næste generation sequencing undersøgelser eller udvikle andre Discovery-baserede tilgange. I denne betænkning præsenterer vi en enkel protokol, understøttes af en fleksibel tjekliste, som kan tilpasses bredt til brug langt ud over præsenteres undersøgelse system. Det er håbet, at denne protokol kan tjene som en omfattende ressource for Fællesskabets Astyanax og videre.
Introduction
In situ hybridisering er en fælles metode for farvning faste væv for at visualisere gen expression mønstre1. Denne teknik er blevet udført i år i andre traditionelle2 og ikke-traditionelle3 modelsystemer, for en bred vifte af biologiske undersøgelser. Dog er flere trin og reagenser, der nødvendige for at fuldføre denne procedure. For efterforskerne, der aldrig har udført denne teknik, kan indlede processen være skræmmende på grund af de mange trin involveret. Yderligere, den langvarige karakter af denne procedure egner sig til tekniske fejl, som kan være en udfordring for at fejlfinde.
Det overordnede mål med denne artikel er at præsentere en enkel og ligetil metode, der vil gøre denne hybridisering teknik har adgang til et bredt publikum. For at reducere indførelsen af fejl, præsenterer vi en enkel tilgang, der giver høj kvalitet gen expression farvning og minimerer uspecifikke baggrund signal. Denne procedure er magen til andre metoder udviklet i traditionelle modelsystemer, såsom Danio rerio4. Her, vi sigter mod at lette omhyggelig gennemførelse af hvert trin ved hjælp af en downloades tjekliste (supplerende fil 1), at fremme omhyggelig gennemførelse af protokollen. Begrundelsen herfor er at lette organisation gennem de mange trin i denne procedure. Denne artikel er relevant for forskere interesseret i at udføre hele-mount in situ hybridisering i udviklingen af embryoner, men endnu har udført ikke proceduren. Fordelen ved den valgte metode for Astyanax forskere er at det er blevet testet og bevist i både cavefish og overflade fisk morphs, hvilket letter sammenlignende udtryk analyser. Metoden præsenteres kan bruges af forskere i undersøgelser af Astyanax og andre systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af sårbarheden af RNA til nedbrydning vedrører et af de mest kritiske trin i protokollen sterile syntesen af RNA sonden. Men hvis en sonde genereres omhyggeligt, og giver gode resultater, det kan genbruges i efterfølgende farvning reaktioner. Et andet afgørende skridt er forsigtige produktionen af alle reagenser, der anvendes i hele protokollen. Da denne protokol omfatter flere dage og mange små skridt, det er vigtigt at alle reagenser er præcist produceret og gemt i en steril måde. Endvidere er det vigt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af de grove lab for nyttige kommentarer på dette håndskrift. Vi vil gerne anerkende fire gymnasieelever, der udnyttede denne protokol i løbet af sommeren praktikpladser i 2017 og 2018, herunder Christine Cao, Michael Warden, Aki Li og David Nwankwo. HL blev støttet af en UC biologi STILK Fellowship i løbet af sommeren i 2017. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Foundation (DEB-1457630 til JBG), og de nationale institutter for Dental og Craniofacial forskning (NIH; DE025033 til JBG).
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
Riferimenti
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
